一种卵形鲳鲹β‑胸腺素及其应用制造技术

一种卵形鲳鲹β‑胸腺素及其应用，本发明专利技术涉及分子生物学领域，所述卵形鲳鲹β‑胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2，本发明专利技术还提供所述卵形鲳鲹β‑胸腺素在抗细菌疾病药物及其应用，以及卵形鲳鲹β‑胸腺素的重组蛋白表达方法，本发明专利技术的β‑胸腺素能够显著抑制致病菌的生长，并且注射鱼类之后能够显著提高鱼类的抗病能力。

A trachinotusovatus beta thymosin and its application

A trachinotusovatus beta extrasin and application, the present invention relates to the field of molecular biology, the trachinotusovatus beta thymosin cDNA nucleotide sequence of SEQ ID NO.1, amino acid sequence of SEQ ID NO.2, the invention also provides the trachinotusovatus beta thymosin in anti bacterial diseases and its application, and trachinotusovatus beta thymosin recombinant protein expression method, the invention of the beta thymosin can significantly inhibit the growth of pathogenic bacteria, and fish after injection can significantly improve the disease resistance of fish.

【技术实现步骤摘要】
一种卵形鲳鲹β-胸腺素及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体说的是一种卵形鲳鲹β-胸腺素及其作为免疫增强剂在抗细菌性疾病性能方面的应用。
技术介绍
卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)是我国海南、广东和广西等南方沿海地区重要的海水养殖鱼类，随着养殖规模的不断扩大，病害发生日益严重。胸腺是机体免疫系统中重要的中枢免疫器官之一，胸腺素是由Goldstein和White在1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中分离得到的具有生活活性的多肽类物质。其中β-胸腺素结构高度保守，由40-44个氨基酸残基组成，分子质量约为5.0kD。胸腺素不仅具有免疫调节活性，促进T细胞的成熟的作用，同时在调节生殖系统、神经内分泌系统中亦具有重要作用。目前胸腺素作为一种免疫调节剂或增强剂，已经在医学临床广泛运用。由于其能够协调内分泌，调节免疫平衡，提高机体抵抗外界病原的入侵，在兽医临床的防治试验中也有不错的效果。然而鱼类β-胸腺素的功能和应用潜能尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种卵形鲳鲹β-胸腺素及其抗病性能方面的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种卵形鲳鲹β-胸腺素，所述卵形鲳鲹β-胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQIDNO.1：ACTACTGCTGCAACGCACTGACCAGAGACCTTCCAGCGATCCCGTCAGCCAACGCTTCGACTCTCTGCAACCATGAGTGACAACAAGCCCGACATCTCAGACGTGACCAGCTTCGACAAGACCAAACTGAAGAAGACGGAGACTCAAGAGAAAAACACACTGCCAACCAAAGAAACCATCGAACAGGAGAAGTCAGAGTCATCATGAAGATCAGTCCTCCTGTACACTGCACATTCCACAAGCCTTGCCTCTTTCAACCTTTTCCAACATGTATTCCAAGTTGCAGAACTTAATAATTGACAAAACGTTGGCTGTACAACCACACAACTCAACTTGCCTAGATGTCCCTCTGGTACAGTGAGGAAGTGGTGGCTCAATGTCGGCATGAGTTCCTGGTCACCTGTTTTTTGCTGGGGCTGTATCTCAAGGTGTCATGAAACAACTGAGGGACCTACACTTCATGATTTGTAGCCCTGCTCTAGCCACCTGTGAATGCTCACAAAGCAAGCTGTTTCTTTTTGTAAAAAAAAATCTGGAATGCACAAGTTTGTTAAATATGCAAAATAAAAAATGTAAACTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；所述卵形鲳鲹β-胸腺素的的氨基酸序列如SEQIDNO.2：MSDNKPDISDVTSFDKTKLKKTETQEKNTLPTKETIEQEKSESS本专利技术还提供所述卵形鲳鲹β-胸腺素在鱼类抗细菌疾病药物。本专利技术还提供所述卵形鲳鲹β-胸腺素在鱼类抗细菌疾病药物中的应用。进一步，所述的细菌为缓爱德华氏菌病、哈维氏弧菌病或无乳链球菌病。本专利技术提供了卵形鲳鲹β-胸腺素抗病基因及其编码蛋白质的重组表达方法，具体为提取卵形鲳鲹的RNA，将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过PCR获得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列为：TroTβ-F：5’-gatatcATGAGTGACAACAAGCCC-3’；TroTβ-R：5’-gatatcTGATGACTCTGACTTCTCC-3’。反应条件：94℃预变性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸5min；扩增后的片段经胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落进行PCR检测；检测正确后提取重组质粒，EcoRV限制性内切酶酶切后回收132bp片段；提取PET-32a质粒同时质粒经EcoRV酶切后，利用T4连接酶将上述132bp回收片段连接构建重组质粒；重组质粒经基因测序验证含有β-胸腺素基因，将其命名为pTroTβ；将上述的质粒pTroTβ用常规方法转入表达菌株BL21感受态细胞中，在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12-20小时，挑取阳性转化子，将其命名为BL21/pTroTβ；将BL21/pTroTβ菌株接种至含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃条件下，200rpm/min振荡培养至OD600约为0.6，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L进行诱导表达，30℃条件下继续以200rpm/min摇动培养6h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入6ml裂解液，-80℃速冻之后，4℃解冻，而后再进行超声破碎后，以10000g,4℃离心30min,回收上清液并进行层析柱回收纯化。本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术的β-胸腺素能够显著抑制致病菌的生长，并且注射鱼类之后能够显著提高鱼类的抗病能力。附图说明图1为本专利技术实施提供的诱导及纯化的β-胸腺素蛋白电泳图。泳道M，分子量标准；泳道2，对照；泳道3，β-胸腺素诱导；泳道4，β-胸腺素纯化。图2为本专利技术实施提供的纯化的β-胸腺素蛋白抑制致病菌生长的生长曲线图。A为抑制迟缓爱德华氏菌生长曲线图，B为抑制哈维氏弧菌生长曲线图，C为抑制无乳链球菌生长曲线图。其中空心圆形曲线为对照蛋白，实心圆形曲线为本专利技术实施提供的纯化的β-胸腺素蛋白。图3为实验鱼注射纯化的β-胸腺素蛋白后肾脏、脾脏及肝脏中的细菌在各个时间点的数量图：A、肝脏，B、脾，C、肾。具体实施方式下面通过实施例来对本专利技术的技术方案作进一步解释，但本专利技术的技术方案不受实施例任何形式上的限制。实施例一种卵形鲳鲹β-胸腺素，所述卵形鲳鲹β-胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQIDNO.1；所述卵形鲳鲹β-胸腺素的的氨基酸序列如SEQIDNO.2。提取卵形鲳鲹的RNA，将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过PCR获得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列为：TroTβ-F：5’-gatatcATGAGTGACAACAAGCCC-3’；TroTβ-R：5’-gatatcTGATGACTCTGACTTCTCC-3’。反应条件：94℃预变性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。扩增后的片段经胶回收后与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落进行PCR检测。检测正确后提取重组质粒，EcoRV限制性内切酶酶切后回收132bp片段。提取PET-32a质粒同时质粒经EcoRV酶切后，利用T4连接酶将上述132bp回收片段连接构建重组质粒。重组质粒经基因测序验证含有β-胸腺素基因，将其命名为pTroTβ。β-胸腺素重组蛋白的诱导表达和纯化将上述的质粒pTroTβ用常规方法转入表达菌株BL21感受态细胞中(购于全式金科技有限公司，北京)，在含有氨苄青霉素(50ug/ml)的LB固体培养基上培养12-20小时，挑取阳性转化子，将其命名为BL21/pTroTβ。将BL21/pTroTβ菌株接种至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵形鲳鲹β‑胸腺素，其特征在于所述卵形鲳鲹β‑胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.一种卵形鲳鲹β-胸腺素，其特征在于所述卵形鲳鲹β-胸腺素的cDNA核苷酸的序列如SEQIDNO.1。2.根据权利要求1所述的一种卵形鲳鲹β-胸腺素，其特征在于卵形鲳鲹β-胸腺素的氨基酸序列如SEQIDNO.2。3.根据权利要求1所述的一种卵形鲳鲹β-胸腺素，其特征在于所述卵形鲳鲹β-胸腺素在鱼类抗细菌疾病药物。4.根据权利要求1所述的卵形鲳鲹β-胸腺素在鱼类抗细菌疾病药物中的应用。5.根据权利要求3或4所述的细菌为缓爱德华氏菌病、哈维氏弧菌病或无乳链球菌病。6.权利要求1所述卵形鲳鲹β-胸腺素的重组蛋白表达方法，具体为提取卵形鲳鲹的RNA，将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过PCR获得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列为：TroTβ-F：5’-gatatcATGAGTGACAACAAGCCC-3’，TroTβ-R：5’-gatatcTGATGACTCTGACTTCTCC-3’；反应条件：94℃预变性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸5min；扩增后的片段经胶回收后与pMD1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙云，周永灿，陈晓娟，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46