用于MALDI的样品制备方法及其自动化系统技术方案

用于制备生物学样品以便通过Maldi进行测试的方法，其中此类方法基于样品参数进行选择。针对一定范围样品参数(例如，McFarland、分配体积和分配次数)获得Maldi分数。从该数据，能够选择被制备用于进行Maldi测试的生物学样品的样品制备参数。一种样品制备策略使用多次分配样品而其间具有干燥步骤，这产生更准确的Maldi分数，尤其是对于在低范围的McFarland值(例如，低于约2)的样品。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于MALDI的样品制备方法及其自动化系统相关申请的交叉引用本申请要求在2014年8月18日提交的美国临时申请No.62/038,509的申请日权益，该申请的公开内容在此通过引用被并入本文。
技术介绍
作为医学诊断和治疗中的惯例，从患者获得诸如血液或尿液的生物学样品并分析微生物的存在。如果确定微生物存在，则进行医学和经济学两方面的论证以鉴别存在的具体微生物，并且为了促进治疗还鉴别出该微生物的抗生素抗性/易感性。通常必须快速进行这样的确定以确保尽可能快地开始正确的治疗。例如，败血症是由于宿主免疫系统对感染的极大响应而导致的严重医学病症。它能够触发大面积炎症，从而能够产生受损的血液流动。当败血症发作时，身体的器官会缺少氧气和营养，从而造成永久损伤和最终的衰竭。在不够恰当的诊断或未作治疗的情况下，心脏衰弱并且会发生感染性休克，从而导致多器官衰竭和死亡。需要血培养来检测败血症患者的血液内细菌或酵母菌的存在，以鉴别(一种或多种)微生物的存在并指导治疗。从血培养中进行(一种或多种)微生物的常规分离和鉴别花费至少24-48小时，这导致许多败血症患者刚开始是用不恰当的抗生素治疗的。因此希望的是快速从阳性培养(血液、脑脊髓液等等)中分离并鉴别微生物。近来，已经显示，某些蛋白质组学技术/工具，诸如基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱术(“MALDI-TOFMS”)(下文中的“Maldi”)，提供了从阳性血培养(“PBC”)或从在诸如琼脂平板的基底上生长的细菌菌落中快速且准确地鉴别出细菌和/或真菌。在Maldi过程中，来自在营养培养基中以常规方式培养的菌落的少量微生物被转移到被称为Maldi板的质谱样品支撑板，并且然后直接进行质谱分析，一般是通过飞行时间(TOF)进行。该质谱分析显示出不同的蛋白质，前提是它们在微生物中以足够的浓度存在。接着由微生物的蛋白质特征曲线、通过对包含数千个参考谱图的谱图库进行计算机检索来确定微生物的身份。如果在库中针对所检查的确切物种的微生物不存在参考质谱图，则具有更宽松的相似性要求的计算机库检索能够提供对于微生物的顺序、家族或属的至少某些指示，因为相关的微生物往往包含多种相同的蛋白质类型。在UlrichWeller的、标题为“IdentificationofPathogensinBodilyFluids(体液中病原体鉴别)”的国际公开号WO-2009/065580A1中进一步详细地描述了Maldi过程，该申请的全部内容在此被并入。可以使用多种质谱仪器用于鉴别。PBC样品中的微生物能够在Maldi鉴别之前例如在琼脂平板上进行传代培养。在替代方案中，能够使用不同的样品制备方法将微生物从PBC样品中分离，而不需要进行传代培养。一般将微生物分离物直接涂到Maldi板上以获得约70％-80％的鉴别准确性。对于未给出任何鉴别的分离物，典型地使用后续液体提取方法来从微生物中提取蛋白质以用于改善的MALDI-TOFMS鉴别。虽然这些液体蛋白质提取方法通常给出了更好的鉴别准确性，但这样的方法不仅要求若干离心步骤而且还是费时的。Schmidt,V等人“Rapididentificationofbacteriainpositivebloodculturebymatrix-assistedlaserdesorptionionizationtime-of-flightmassspectrometry(通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱术快速鉴别阳性血培养中的细菌)”，Eur.J.Clin.Microbiol.InfectDis.第31卷第3期，第311-317页(2012年3月)(电子出版日2011年6月23日)公开了一种从阳性血培养中鉴别细菌的方法，该方法是将被隔离细菌的液体样品点到Maldi板上并在所点的液体样品上直接覆盖25％的甲酸。因此，细菌样品中甲酸的最终浓度是小于25％。Schmidt的方法对革兰氏阴性细菌得到了86.6％的鉴别准确性并且对革兰氏阳性细菌得到了60％的鉴别准确性。Schmidt没有报告以酵母菌试验这种方法。Hyman,J等人(美国专利公开号2010/0120085，公开日2010年5月13日)公开了与Schmidt相似的方法，其中将完好的处于溶液中的被分离微生物直接涂到Maldi板上。接着将该液体样品用大致相等体积的50％甲酸覆盖。因此，添加至样品中的甲酸的最终浓度是大致25％。在14个不同物种的细菌和酵母菌上试验了这种方法。虽然此方法获得了91.1％的鉴别率，但该数据没有指示此方法对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或酵母菌有多有效。Haigh等人“ImprovedPerformanceofBacteriumandYeastIdentificationbyaCommercialMatrix-AssistedLaserDesorptionIonisation-TimeofFlightMassSpectrometrySystemintheClinicalMicrobiologyLaboratory(在临床微生物学实验室中通过商用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱术系统进行细菌和酵母菌鉴别的改进性能)，”J.Clin.Microbiol.第49卷第9期，第3441页(2011年9月)描述了一种方法，其中使用无水甲酸来提取直接涂到Maldi板上的微生物蛋白质。然而，这种方法不能成功地鉴别酵母菌和革兰氏阳性细菌的所有菌株。Herendael等人“Validationofamodifiedalgorithmfortheidentificationofyeastisolatesusingmatrix-assistedlaserdesorption/ionisationtime-of-flightmassspectrometry(MALDI-TOFMS)(修正后算法在使用基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱术(MALDI-TOFMS)鉴别酵母菌分离物中的验证)”，Eur.J.Clin.Microbiol.InfectDis.第31卷第5期，第841-848页(2012年5月)(电子出版日2011年8月23日)描述了用于鉴别酵母菌的两种方法。Herendael等人描述的标准提取方法是常规的液体提取方法。在Herendael等人描述的短的提取方法中，从琼脂平板挑选出一个菌落并直接施加到目标Maldi板上。将甲酸(1μL，浓度为70％)加入该样品中并允许该样品干燥。将干燥后的样品用Maldi基质覆盖、允许其进一步干燥、并通过MALDI-MS进行分析。该短的提取方法提供了与该标准提取方法相同的结果，但短的提取方法的Maldi分数较低。用该短的提取方法可以鉴别几乎所有的分离物(97.6％)；然而这些鉴别率中的17.1％低于1.7的可靠阈值水平。虽然该提取方法提供了准确的结果，但检测时间(TTD)远小于通过直接涂进行的检测。因此，寻求使用直接涂Maldi改善了鉴别准确性的方法。
技术实现思路
所公开的方法的各种实施例能够实现从阳性血培养(“PBC”)或在基底上培养的细菌菌落的纯分离物中通过使用Maldi的质谱术来直接鉴别微生物。在本专利技术的一个实施例中，使用溶液分配/分层方法来制备用于Maldi的样品。在本文描述的溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备生物学样品以便通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱术进行评估的方法，所述方法包括：获得生物学样品；稀释所述样品；将被稀释的样品的第一等分部分施加至被适配成用于将样品递送至被配置为执行质谱术的装置的表面；干燥所述样品；在所述干燥的第一等分部分上施加所述样品的第二等分部分；干燥所述样品；在所述干燥的样品上施加基质，所述基质被适配成在所述质谱仪中使用；并且对所述样品执行质谱术。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.18 US 62/038,5091.一种用于制备生物学样品以便通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱术进行评估的方法，所述方法包括：获得生物学样品；稀释所述样品；将被稀释的样品的第一等分部分施加至被适配成用于将样品递送至被配置为执行质谱术的装置的表面；干燥所述样品；在所述干燥的第一等分部分上施加所述样品的第二等分部分；干燥所述样品；在所述干燥的样品上施加基质，所述基质被适配成在所述质谱仪中使用；并且对所述样品执行质谱术。2.如权利要求1所述的方法，其中通过将所述样品与无菌稀释剂组合来稀释所述样品。3.如权利要求1所述的方法，其中所述生物学样品是从培养平板挑选出的微生物菌落的一部分。4.如权利要求1所述的方法，其中所述生物学样品是从阳性血培养中采集的。5.如权利要求1所述的方法，其中所述表面是被适配成在所述质谱仪中使用的平板。6.如权利要求1所述的方法，进一步包括：测量所述被稀释的样品的浊度，其中所述被稀释的样品具有约1McFarland至约2McFarland的浊度，所述方法进一步包括：将约3μl的第一等分部分施加到所述表面上；干燥所述样品；并且将约3μl的第二等分部分施加到所述表面上。7.如权利要求1所述的方法，其中所述基质溶液选自由如下项构成的组：α-氰基-4-羟基桂皮酸(HCCA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、3,5-二甲氧基-4-羟基桂皮酸(SPA)、3-羟基吡啶甲酸(HPA)、3,4-二羟基桂皮酸、2-(4-羟基苯偶氮基)-苯甲酸、2-氨基-4-甲基-5-硝基吡啶、以及2,4,6-三羟基苯乙酮(THAP)。8.如权利要求1所述的方法，其中所述干燥步骤是在约室温至约45℃的温度下。9.如权利要求1所述的方法，其中在施加所述样品之后，用包含挥发性酸、有机溶剂及其组合中的至少一种的试剂来处理所述样品。10.如权利要求9所述的方法，其中所述挥发性酸是至少70％甲酸。11.如权利要求10所述的方法，其中所述甲酸与有机溶剂组合，并且所述有机溶剂选自由以下项构造的组：乙腈、甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯。12.如权利要求1所述的方法，进一步包括测量所述被稀释的样品的浊度，其中所述被稀释的样品具有约0.5McFarland至小于约1McFarland的浊度，所述方法进一步包括：将约3μl的第一等分部分施加到所述表面上；干燥所述样品；将约3μl的第二等分部分施加到所述表面上；干燥所述样品；将约3μl的第三等分部分施加到所述样品上；并且干燥所述样品。13.如权利要求1所述的方法，进一步包括：测量所述被稀释的样品的浊度，其中所述被稀释的样品具有约0.25McFarland至小于约0.5McFarland的浊度，所述方法进一步包括：将约3μl的第一等分部分施加到所述表面上；干燥所述样品；将约3μl的第二等分部分施加到所述表面上；干燥所述样品；将约3μl的第三等分部分施加到所述样品上；干燥所述样品；将约3μl的第四等分部分施加到所述样品上；并且干燥所述样品。14.一种用于制备生物学样品以便通过基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱术进行评估的方法，所述方法包括：获得生物学样品；稀释所述样品；测量所述样品浓度；如果测量的样品浓度在预定范围内，则将样品的第一预定等分部分施加到被适配成用于将样品递送到被配置为执行质谱术的装置的表面；如果测量的样品浓度高于所述预定范围，则将样品的第二预定等分部分施加到被适配成用于将样品递送至被配置为执行质谱术的装置的表面，其中所述第二预定等分部分小于所述第一预定等分部分；如果测量的样品浓度低于所述预定范围，i)将所述样品的第一等分部分施加至被适配成用于将样品递送至被配置为执行质谱术的装置的表面；ii)干燥所述样品；iii)在所述干燥的第一等分部分上施加所述样品的第二等分部分；iv)干燥所述样品；在所述沉积的样品上施加基质，所述基质被适配成在所述质谱仪中使用；并且对所述样品执行质谱术。15.如权利要求14所述的方法，其中通过吸光度、透光度、指南或比浊法之一来测量所述浊度。16.如权利要求15所述的方法，其中通过比浊法来测量所述浊度。17.如权利要求14所述的方法，其中所述生物学样品是从培养平板挑选出的微生菌落物的一部分。18.如权利要求14所述的方法，其中所述生物学样品是从阳性血培养采集的。19.如权利要求14所述的方法，其中所述表面是被适配成在所述质谱仪中使用的平板。20.如权利要求16所述的方法，其中所述预定范围是约2McFarland至约6McFarland，并且其中所述被稀释的样品具有约1McFarland至小于约2McFarland的浊度，所述第一等分部分和所述第二等分部分二者均是约3μl。21.如权利要求14所述的方法，其中所述基质溶液选自由以下项构成的组：α-氰基-4-羟基桂皮酸(HCCA)、2,5-二...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·怀尔斯，J·D·曼特罗，
申请(专利权)人：贝克顿·迪金森公司，
类型：发明
国别省市：美国,US