重组蛋白的高效选择性制造技术

本发明专利技术提供一种新的表达系统，所述表达系统包含促进糖蛋白的所需翻译后修饰的哺乳动物选择性标记。具体地讲，本发明专利技术包括通过采用以哺乳动物来源的GPT基因为基础的选择标记系统在哺乳动物细胞中实现最佳重组蛋白表达的方法和组合物。本发明专利技术包括在哺乳动物细胞中促进重组蛋白的选择性以及增加表达拷贝和蛋白产率的方法，和使用GPT表达系统的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组蛋白的高效选择性
技术介绍
序列表本申请以引用方式并入以计算机可读形式提交的序列表，该序列表于2015年8月3日创建为文件8700WO_ST25.txt(75,769字节)。
本专利技术提供重组蛋白在哺乳动物细胞中以一致和高效的方式表达。具体地讲，本专利技术包括通过采用哺乳动物选择标记在哺乳动物细胞中实现改善的蛋白表达的方法和组合物。本专利技术包括在哺乳动物细胞中促进重组蛋白的选择性以及增加表达拷贝数和蛋白产率的方法，和使用此类表达系统的方法。相关领域说明细胞表达系统的开发是提供用于研究和治疗用途的可靠且高效的给定蛋白来源的重要目标。由于例如哺乳动物表达系统对重组蛋白进行适当的翻译后修饰的能力，哺乳动物细胞中的重组蛋白表达就制备治疗性蛋白而言通常是优选的。有多种载体可用于在哺乳动物宿主中表达，它们各自含有使得能够在细胞培养期间容易地分离表达重组蛋白的细胞的选择标记。在此类系统中利用选择性标记基因(SMG)，原因是它们为表达所关注蛋白的细胞赋予选择性优势，然而，SMG必须就其表型中性、高效性和多能性等原因进行优化。尽管有许多宿寄SMG的载体和表达系统可用，但在哺乳动物系统中实现的重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的细胞，包含编码与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少93％同一性的蛋白的哺乳动物衣霉素(Tn)抗性基因，所述基因可操作地连接到所关注基因(GOI)和至少一个调控元件。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.19 US 62/039,4161.一种分离的细胞，包含编码与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少93％同一性的蛋白的哺乳动物衣霉素(Tn)抗性基因，所述基因可操作地连接到所关注基因(GOI)和至少一个调控元件。2.根据权利要求1所述的分离的细胞，其中所述Tn抗性基因外源性添加到所述细胞。3.根据权利要求1或2所述的分离的细胞，其中所述Tn抗性基因编码与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少95％同一性的蛋白。4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的细胞，其中所述Tn抗性基因编码与SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少98％同一性的蛋白。5.根据权利要求1或2所述的分离的细胞，其中所述Tn抗性基因包括选自以下的核酸序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17。6.根据权利要求1或2所述的分离的细胞，其中所述Tn抗性基因包括含有SEQIDNO:12的核酸序列。7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的细胞，其中所述至少一个调控元件选自启动子、核糖体结合位点和增强子。8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的细胞，还包括第二所关注基因(GOI)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的分离的细胞，其中所述所关注基因(GOI)为外源性添加的GOI。10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的细胞，其中所述外源性添加的GOI为人类基因。11.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的细胞，其中所述调控元件为外源性添加的调控元件。12.根据权利要求1至11中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一GOI和/或第二GOI选自抗体重链、抗体轻链、抗原结合片段和Fc融合蛋白。13.根据权利要求8至12中任一项所述的分离的细胞，其中所述第一GOI和所述第二GOI独立地选自编码抗体轻链或其抗原特异性片段、抗体重链或其抗原特异性片段、Fc融合蛋白或其片段以及受体或其配体特异性片段的基因。14.根据权利要求1至113中任一项所述的分离的细胞，其中所述GOI可操作地连接到启动子。15.根据权利要求1至14中任一项所述的分离的细胞，其中所述GOI编码选自抗体轻链或其抗原结合片段、抗体重链或其抗原结合片段、Fc融合蛋白或其片段、配体以及受体或其配体结合片段的糖蛋白。16.根据权利要求8至15中任一项所述的分离的细胞，其中重组酶识别位点存在于所述第一GOI与所述第二GOI之间。17.根据权利要求8所述的分离的细胞，还包括在所述第一GOI的5’的重组酶识别位点和相对于所述第二GOI在3’的重组酶识别位点。18.根据权利要求1至17中任一项所述的分离的细胞，其中所述细胞为真核细胞。19.根据权利要求1至18中任一项所述的分离的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。20.根据权利要求1至18中任一项所述的分离的细胞，其中所述细胞选自CHO-K1、COS-7、HEK293、肿瘤细胞、淋巴细胞、视网膜细胞和干细胞。21.根据权利要求1至20中任一项所述的分离的细胞，其中所述细胞为CHO-K1细胞。22.一种制备重组的所关注蛋白(POI)的方法，其中所述方法包括：a.提供编码核酸分子的哺乳动物宿主细胞，所述细胞包含(i)哺乳动物衣霉素(Tn)抗性基因以及(ii)编码所述POI的基因；b.在第一浓度的Tn存在下培养所述细胞；c.分离表达所述Tn抗性基因的至少一个拷贝的细胞群；d.在增加浓度的Tn存在下培养所述细胞群，其中增加Tn的浓度增加所述POI的产生；以及e.从细胞培养中分离所述POI。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物Tn抗性基因包括与SEQIDNO:2的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物Tn抗性基因包括与SEQIDNO:2的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列。25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物Tn抗性基因包括中国仓鼠(Cricetulusgriseus)Tn抗性基因。26.根据权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物Tn抗性基因包括人类Tn抗性基因。27.根据权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物Tn抗性基因包括选自以下的核酸序列：SEQIDNO:2、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·德什潘德，D·布拉科夫，陈刚，J·凡德尔，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US