基于Gβγ互作蛋白监测G蛋白激活的生物传感器制造技术

描述了用于评估G蛋白活性的基于共振能量转移(RET)或蛋白片段互补测定的生物传感器。这些生物传感器基于Gα亚基和Gβγ互作蛋白之间竞争结合于Gβγ二聚体。这些生物传感器包括：与适当的RET或PCA标记融合的(1)βγIP和(2)Gβ或Gγ蛋白；GPCR；或质膜靶向域。还描述了使用这样的传感器用于不同的应用的方法，所述应用包括对调节G蛋白活性的试剂的鉴别或对GPCR信号传导/调节的表征的鉴别如GPCR的G蛋白偏好和激活谱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于Gβγ互作蛋白监测G蛋白激活的生物传感器相关申请的交叉引用本申请要求于2014年10月14日提交的美国临时申请号62/063,622的权益，其通过引用全文并入本文。
本专利技术涉及对G蛋白激活的监测，更特别地涉及用于检测G蛋白激活的信号传导生物传感器。
技术介绍
异源三聚体G蛋白由三个亚基组成：α、β和γ，该异源三聚体G蛋白向各种胞内效应物传递由G蛋白偶联受体(GPCR)提供的信息。在缺乏刺激的情况下，G蛋白的α-亚基与GDP(鸟苷二磷酸)分子形成复合体。配体激活受体后的构象变化促进了GDP分子磷酸化为GTP(鸟苷三磷酸)。结合GTP的Gα亚基与Gβγ亚基解离，然后两者能够与下游效应物相互作用和调节下游效应物的活性。因此，使用Gβγ互作蛋白，通过下游效应物与Gβγ的相互作用分析下游效应物来评估G蛋白的激活。在Gα亚基将GTP水解为GDP后，Gα对Gβγ的亲和力恢复，并且三个亚基重结合，形成无活性的异源三聚体G蛋白，结束效应物的参与，从而发生信号转导(Gilman1987)。除了GPCR对G蛋白的经典激活以外，其他蛋白质也可以调节这些异源三聚体G蛋白的活性，如G蛋白信号传导调节因子(RGS)、G蛋白信号传导激活因子(AGS)和抗胆碱酯酶8蛋白抑制因子(resistancetoinhibitorsofcholinesterase8proteins，Ric-8)。在这些非典型信号转导通路中的某些中，另一种蛋白(例如Ric-8)替代了由GPCR经典地发挥的鸟嘌呤交换因子(GEF)活性(Boularan和Kehrl，2014)。G蛋白偶联受体激酶(GRKs)2和G蛋白偶联受体激酶3首先以其在受体脱敏中的作用为特征，其也是通过与Gβγ亚基的相互作用参与的效应物。GRK2和GRK3含有普列克底物蛋白同源(PH)域，所述普列克底物蛋白同源(PH)域在G蛋白的Gβγ亚基与激活的结合GTP的Gα亚基解离时，与G蛋白的Gβγ亚基相互作用(Pitcher，Inglese等人.1992)(Touhara，Inglese等人.1994)。因此，Gβγ互作蛋白(βγIP)(如GRK2和GRK3)可以用于直接研究GPCR或其他G蛋白激活因子对G蛋白的激活。当前，药物开发工业中使用几种方法评估GPCR的激活和由此评估受体连接G蛋白，如钙动员测定或基于通过G蛋白结合的GTPγS的放射性测定。钙动员测定测量发生在Gq激活下游的信号传导事件，并且仅当与使用修饰的Gα亚基偶联时可以应用于Gi偶联受体或Gs偶联受体。在GTPγS结合测定的情况下，使用放射性GTPγ35S在细胞膜上直接测量各种异源三聚体G蛋白的激活，该异源三聚体G蛋白的激活不能在活细胞中进行。由此，到目前为止尚未探索在不修饰G蛋白的激活因子或Gα亚基的情况下在活细胞中激活G蛋白。此外，已知的方法不适合于使用相同的检测配偶体研究所有不同的G蛋白。这样的测定在药物开发过程的不同阶段中是尤其有用的，例如，通过使G蛋白偶联谱能够表征和促进对具有限定的信号传导特性的新化合物的鉴定以用于筛选测定和结构-活性关系研究。这是尤其真实的，因为G蛋白激活因子作为药物靶标的重要性，其占所有通过GPCR起作用的处方药中的26％(Garland2013)。尽管有几种方法可以用于支持开发新的靶向G蛋白激活因子的治疗活性分子，但那些化合物的精确作用机制的可用信息的缺乏常常限制新型药物的发现。因此，存在新的评估G蛋白激活的工具和测定的需求。本说明书参考许多文献，所述文献的内容通过引用全文并入本文。
技术实现思路
本专利技术提供了以下的1至68个项目：1.用于检测G蛋白活性的生物传感器系统，所述生物传感器系统包括(A)或(B)中定义的元件：(A)(i)第一生物传感器，其包括：第一组件，其包括融合于(a)共振能量转移(RET)供体；(b)RET受体或(c)报告蛋白的第一片段的Gβγ互作蛋白(βγIP)；和第二组件，其包括融合的Gβ蛋白或融合的Gγ蛋白，其中所述Gβ蛋白或所述Gγ蛋白融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)所述报告蛋白的第二片段；(ii)第二生物传感器，其包括：(i)中定义的第一组件和第二组件；和包括重组Gα蛋白的第三组件；其中，(a)如果所述βγIP融合于所述RET供体，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述RET受体；(b)如果所述βγIP融合于所述RET受体，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述RET供体；(c)如果所述βγIP融合于所述报告蛋白的第一片段，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述报告蛋白的第二片段；或(B)(i)生物传感器，其包括第一组件，其包括融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)报告蛋白的第一片段的Gβγ互作蛋白(βγIP)；第二组件，其包括融合的G蛋白偶联受体(GPCR)，其中所述GPCR在其C端融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)所述报告蛋白的第二片段；第三组件，其包括重组Gα蛋白；其中，(a)如果所述βγIP融合于所述RET供体，则所述GPCR融合于所述RET受体；(b)如果所述βγIP融合于所述RET受体，则所述GPCR融合于所述RET供体；(c)如果所述βγIP融合于所述报告蛋白的第一片段，则所述GPCR融合于所述报告蛋白的所述第二片段。2.项目1所述的生物传感器系统，其中所述Gγ蛋白融合于所述RET供体、RET受体或第二片段。3.项目1或2所述的生物传感器系统，其中所述RET供体、RET受体或第二片段融合于所述Gβ或Gγ蛋白的N端。4.项目1至3中任一项所述的生物传感器系统，其中所述RET供体、RET受体或第一片段融合于所述βγIP的C端。5.项目1至4中任一项所述的生物传感器系统，其中所述βγIP融合于所述RET受体，并且所述Gβ蛋白、Gγ蛋白或GPCR融合于所述RET供体。6.项目1至5中任一项所述的生物传感器系统，其中所述RET供体是生物发光蛋白。7.项目6所述的生物传感器系统，其中所述生物发光蛋白是荧光素酶。8.项目7所述的生物传感器系统，其中所述荧光素酶是海肾(Renilla)荧光素酶。9.项目1至8中任一项所述的生物传感器系统，其中所述RET受体是荧光蛋白。10.项目9所述的生物传感器系统，其中所述荧光蛋白是GFP。11.项目1至4中任一项所述的生物传感器系统，其中所述βγIP融合于所述第一片段，所述Gβ蛋白、Gγ蛋白或GPCR融合于所述第二片段。12.项目11所述的生物传感器系统，其中所述报告蛋白是生物发光蛋白。13.项目12所述的生物传感器系统，其中所述生物发光蛋白是荧光素酶。14.项目13所述的生物传感器系统，其中所述荧光素酶是海肾荧光素酶。15.项目14所述的生物传感器系统，其中所述第一片段包括海肾荧光素酶的大约第1至110位残基，所述第二片段包括海肾荧光素酶的大约第111至311位残基。16.项目1至15中任一项所述的生物传感器系统，其中，第一组件进一步包括融合于所述βγIP或所述RET供体、RET受体或第一片段的质膜(PM)靶向部分。17.项目16所述的生物传感器系统，其中所述PM靶向部分融合于所述RET供体、RET受体或第一片段的C端。18.项目16或17所述的生物传感器系统，其中所述PM靶向部分包括异戊二烯化基序。19.项本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测G蛋白活性的生物传感器系统，所述生物传感器系统包括(A)或(B)中定义的元件：(A)(i)第一生物传感器，其包括：第一组件，其包括融合于(a)共振能量转移(RET)供体；(b)RET受体或(c)报告蛋白的第一片段的Gβγ互作蛋白(βγIP)；和第二组件，其包括融合的Gβ蛋白或融合的Gγ蛋白，其中所述Gβ蛋白或所述Gγ蛋白融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)所述报告蛋白的第二片段；(ii)第二生物传感器，其包括：(i)中定义的第一组件和第二组件；和包括重组Gα蛋白的第三组件；其中，(a)如果所述βγIP融合于所述RET供体，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述RET受体；(b)如果所述βγIP融合于所述RET受体，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述RET供体；以及(c)如果所述βγIP融合于所述报告蛋白的第一片段，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述报告蛋白的第二片段；或(B)(i)生物传感器，其包括第一组件，其包括融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)报告蛋白的第一片段的Gβγ互作蛋白(βγIP)；第二组件，其包括融合的G蛋白偶联受体(GPCR)，其中所述GPCR在其C端融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)所述报告蛋白的第二片段；第三组件，其包括重组Gα蛋白；其中，(a)如果所述βγIP融合于所述RET供体，则所述GPCR融合于所述RET受体；(b)如果所述βγIP融合于所述RET受体，则所述GPCR融合于所述RET供体；以及(c)如果所述βγIP融合于所述报告蛋白的第一片段，则所述GPCR融合于所述报告蛋白的第二片段。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.10.14 US 62/063,6221.一种用于检测G蛋白活性的生物传感器系统，所述生物传感器系统包括(A)或(B)中定义的元件：(A)(i)第一生物传感器，其包括：第一组件，其包括融合于(a)共振能量转移(RET)供体；(b)RET受体或(c)报告蛋白的第一片段的Gβγ互作蛋白(βγIP)；和第二组件，其包括融合的Gβ蛋白或融合的Gγ蛋白，其中所述Gβ蛋白或所述Gγ蛋白融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)所述报告蛋白的第二片段；(ii)第二生物传感器，其包括：(i)中定义的第一组件和第二组件；和包括重组Gα蛋白的第三组件；其中，(a)如果所述βγIP融合于所述RET供体，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述RET受体；(b)如果所述βγIP融合于所述RET受体，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述RET供体；以及(c)如果所述βγIP融合于所述报告蛋白的第一片段，则所述Gβ或Gγ蛋白融合于所述报告蛋白的第二片段；或(B)(i)生物传感器，其包括第一组件，其包括融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)报告蛋白的第一片段的Gβγ互作蛋白(βγIP)；第二组件，其包括融合的G蛋白偶联受体(GPCR)，其中所述GPCR在其C端融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)所述报告蛋白的第二片段；第三组件，其包括重组Gα蛋白；其中，(a)如果所述βγIP融合于所述RET供体，则所述GPCR融合于所述RET受体；(b)如果所述βγIP融合于所述RET受体，则所述GPCR融合于所述RET供体；以及(c)如果所述βγIP融合于所述报告蛋白的第一片段，则所述GPCR融合于所述报告蛋白的第二片段。2.权利要求1所述的生物传感器系统，其中，所述Gγ蛋白融合于所述RET供体、RET受体或第二片段。3.权利要求1或2所述的生物传感器系统，其中，所述RET供体、RET受体或第二片段融合于所述Gβ或Gγ蛋白的N端。4.权利要求1至3中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述RET供体、RET受体或第一片段融合于所述βγIP的C端。5.权利要求1至4中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述βγIP融合于所述RET受体，并且所述Gβ蛋白、Gγ蛋白或GPCR融合于所述RET供体。6.权利要求1至5中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述RET供体是生物发光蛋白。7.权利要求6所述的生物传感器系统，其中，所述生物发光蛋白是荧光素酶。8.权利要求7所述的生物传感器系统，其中，所述荧光素酶是海肾荧光素酶。9.权利要求1至8中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述RET受体是荧光蛋白。10.权利要求9所述的生物传感器系统，其中，所述荧光蛋白是GFP。11.权利要求1至4中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述βγIP融合于所述第一片段，所述Gβ蛋白、Gγ蛋白或GPCR融合于所述第二片段。12.权利要求11所述的生物传感器系统，其中，所述报告蛋白是生物发光蛋白。13.权利要求12所述的生物传感器系统，其中，所述生物发光蛋白是荧光素酶。14.权利要求13所述的生物传感器系统，其中，所述荧光素酶是海肾荧光素酶。15.权利要求14所述的生物传感器系统，其中，所述第一片段包括海肾荧光素酶的约第1至110位残基，所述第二片段包括海肾荧光素酶的约第111至311位残基。16.权利要求1至15中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述第一组件进一步包括融合于所述βγIP或所述RET供体、RET受体或第一片段的质膜(PM)靶向部分。17.权利要求16所述的生物传感器系统，其中，所述PM靶向部分融合于所述RET供体、RET受体或第一片段的C端。18.权利要求16或17所述的生物传感器系统，其中，所述PM靶向部分包括异戊二烯化基序。19.权利要求16所述的生物传感器系统，其中，所述异戊二烯化基序是人KRAS剪接变体b的异戊二烯化基序。20.权利要求19所述的生物传感器系统，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列KKKKKKSKTKCVIM(SEQIDNO：37)。21.权利要求16至20中任一项所述的生物传感器系统，进一步包括(i)所述RET供体、RET受体或第一片段与(ii)所述PM靶向部分之间的柔性接头。22.权利要求21所述的生物传感器系统，其中，所述柔性接头具有相当于约50至约500个氨基酸的长度。23.权利要求22所述的生物传感器系统，其中，所述柔性接头具有相当于约200个氨基酸的长度。24.权利要求1至23中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述重组Gα蛋白是人Gαq、Gαs、Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαt-锥、Gαt-棒、Gαt-味、Gαz、GαoA、GαoB、Gαolf、Gα11、Gα12、Gα13、Gα14和Gα15/Gα16蛋白，或其混杂的或非选择性的Gα变体。25.权利要求1至24中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述βγIP是GRK2或GRK3。26.权利要求1至25中任一项所述的生物传感器系统，其中，(i)如果所述第二组件包括融合的Gβ蛋白，则所述第一生物传感器和第二生物传感器进一步包括重组Gγ蛋白，或(ii)如果所述第二组件包括融合的Gγ蛋白，则所述第一生物传感器和第二生物传感器进一步包括重组Gβ蛋白。27.权利要求1至25中任一项所述的生物传感器系统，其中，(A)中定义的生物传感器系统进一步包括G蛋白偶联受体(GPCR)。28.权利要求1至27中任一项所述的生物传感器系统，其中，(B)中定义的生物传感器系统进一步包括重组Gβ蛋白和/或重组Gγ蛋白。29.权利要求1至28中任一项所述的生物传感器系统，其中，所述第一生物传感器存在于第一细胞中，所述第二生物传感器存在于第二细胞中。30.权利要求1至28中任一项所述的生物传感器系统，其中，在(A)中定义的生物传感器系统中，所述第一生物传感器存在于第一膜制备物中，所述第二生物传感器存在于第二膜制备物中。31.权利要求1至30中任一项所述的生物传感器系统，其中，(A)中定义的生物传感器系统包括多个第二生物传感器，其中所述第二生物传感器中的每一个包括不同的重组Gα蛋白。32.权利要求31所述的生物传感器系统，其中，所述不同的重组Gα蛋白是以下Gα蛋白中的至少两种：Gαq、Gαs、Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαt-锥、Gαt-棒、Gαt-味、Gαz、GαoA、GαoB、Gαolf、Gα11、Gα12、Gα13、Gα14和Gα15/Gα16。33.一种核酸，包括编码权利要求1至26中任一项定义的第一组件、第二组件和第三组件的序列。34.权利要求33所述的核酸，进一步包括编码Gγ蛋白或Gβ蛋白的序列。35.权利要求33或34所述的核酸，进一步包括一个或多个翻译调节序列。36.权利要求35所述的核酸，其中，所述一个或多个翻译调节序列是内部核糖体进入位点(IRES)。37.一种用于检测G蛋白活性的生物传感器，包括：(i)第一组件，其包括融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)报告蛋白的第一片段的Gβγ互作蛋白(βγIP)；和(ii)第二组件，其包括融合的质膜(PM)靶向部分，其中所述PM靶向部分融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)所述报告蛋白的第二片段；其中，(a)如果所述βγIP融合于所述RET供体，则所述PM靶向部分融合于所述RET受体；(b)如果所述βγIP融合于所述RET受体，则所述PM靶向部分融合于所述RET供体；以及(c)如果所述βγIP融合于所述报告蛋白的第一片段，则所述PM靶向部分融合于所述报告蛋白的第二片段。38.权利要求37所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分是PM蛋白或其定位于PM的片段。39.权利要求38所述的生物传感器，其中，所述PM蛋白或其片段包括(a)棕榈酰化、豆蔻酰化和/或异戊烯化信号序列和/或(b)多碱序列。40.权利要求39所述的生物传感器，其中，所述多碱序列和异戊烯化信号序列来自人KRAS剪接变体b。41.权利要求40所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列KKKKKKSKTKCVIM(SEQIDNO：37)。42.权利要求37至41中任一项所述的生物传感器，其中，所述生物传感器进一步包括第三组件，所述第三组件包括重组Gα蛋白。43.权利要求42所述的生物传感器，其中，所述重组Gα蛋白属于Gq家族。44.权利要求43所述的生物传感器，其中，所述重组Gα蛋白是Gαq或Gα11。45.一种用于确定测试试剂是否调节GPCR的活性的方法，所述方法包括：(1)提供包括(A)、(B)或(C)中定义的元件的生物传感器：(A)(i)第一组件，其包括融合于(a)RET供体；(b)RET受体或(c)报告蛋白的第一片段的Gβγ互作蛋白(βγIP)；(ii)第二组件，其包括融合的Gβ蛋白或融合的Gγ蛋白，其中所述Gβ蛋白或所述Gγ...

【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔·鲍维尔，克里斯蒂安·勒古，米雷列·霍格，维多利亚·卢卡舍娃，
申请(专利权)人：蒙特利尔大学，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA