多层纳米颗粒及其制作方法和使用方法技术

本发明专利技术涉及用于将RNA递送至细胞的多层纳米颗粒及其制作方法和使用方法。所述纳米颗粒包括以交替的带正电荷和带负电荷的聚合物层包覆的核心纳米颗粒，其中所述带负电荷的聚合物层中的至少一个为RNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多层纳米颗粒及其制作方法和使用方法交叉引用本申请要求2013年12月13日提交的美国临时专利申请No.61/915,790的优先权，其内容在此以援引方式全文并入本申请并用于所有用途。
本专利技术涉及用于将RNA递送至细胞和生物体的纳米颗粒及其制作方法和使用方法。
技术介绍
核糖核酸（RNA）是一种核酸分子，与包含脱氧核糖的双链DNA不同，其主要是单链并含有核糖。RNA本质上不如DNA稳定，因其更易于水解。这使得向细胞或生物体提供RNA很困难，因其容易分解，导致生物活性不活跃。核糖核酸酶是催化RNA降解的酶。核糖核酸酶在所有细胞中均非常常见，导致处于未受保护环境中的任何RNA的寿命都非常短。已经发展出的保护RNA不受核糖核酸酶影响的自然机制包括5'端封端，3'端多聚腺苷酸化，RNA蛋白质复合物内的折叠，和核糖核酸酶抑制剂（RI）。但是，RNA向细胞或生物体的递送，因可降解RNA的核糖核酸酶的普遍存在和高耐受性而大大复杂化，给向细胞提供RNA造成了困难。目前，大多通过编码所述RNA的DNA来将RNA递送至细胞，例如以载体的形式，从而在细胞内原位合成RNA。但是，这种方法要求需向细胞引入一系列控制、选择和检测分子。所述附加分子令生产复杂化，且出于细胞毒性考虑，并不总是希望其存在。RNA递送的相关问题随着“RNA干扰”（RNAi）技术——一种由Fire,Mello及其同事在90年代末发现的基因表达调控机制——而升级。RNAi是指对靶细胞或靶器官内的蛋白的特定向下调节。在基因治疗中使用这样的RNAi，则需要将所述RNAi递送到细胞中。类似地，可通过将小干扰RNA（siRNA）分子引入细胞的细胞质中来进行转录后基因沉默，从而改变细胞中的众多多余蛋白质的基因表达。将siRNA，即一种与靶mRNA具有互补性的双链的21-23个核苷酸的RNA双链，分离为单链，即所谓的随从链和引导链。在随从链降解时，将引导链并入RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，结合其互补mRNA并通过RNA酶（argonaute）激活的方式防止其翻译。由于具有简单性和低剂量效应，RNAi技术可以看作一种具有治疗多种疾病的潜力的精妙工具。已报道了各种用于递送siRNA进入细胞质中的方法，如聚合物纳米颗粒（NPs），脂质体和以叶酸、胆固醇、生物素或荧光分子进行表面修饰(Guoetal.,Adv.DrugDel.Rev.2010,62,650;Kapooretal.,IntJPharm,2012,427,35.;andTanetal.,Small2011,7,841.)。为了提高基因沉默效率，病毒载体也已被用于siRNA递送。尽管如此，克服病毒载体致瘤性和免疫原性仍然是基于病毒的siRNA递送的重大障碍(Whiteheadetal.,Nat.Rev.DrugDiscov.2009,8,129.)。目前，裸siRNA的细胞吸收性不佳，会被RNA酶快速降解，且siRNA难以靶向全身性疾病位点，限制了siRNA治疗的广泛使用（Guoetal.,2010）。为了克服所述问题，基于脂质体或聚合物的siRNA递送体系已成功用于局部siRNA递送，尤其是对眼内，皮内，肝脏，神经，肺的标靶而言。除了有效的细胞吸收外，载体的非毒性/无免疫原性和siRNA的有效细胞内递送，对于RNAi作为治疗剂发挥作用均是必需的。因此，目前的研究主要集中在非病毒载体，如基于聚合物的纳米颗粒，来克服这些困难。但是，大多数非病毒载体缺乏可接受的疗效，且具有高水平毒性（Tanetal.,2011）。因此，用于siRNA治疗的有效、安全的递送体系仍然存在挑战。Donathetal.(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1998,37,2201.)首先记载了聚阳离子和聚阴离子的叠层（LBL）在胶体上的自组装。基于带正电荷和带负电荷的聚合物之间的静电相互作用的温和装配，是一种简单的多用途方法，具有高实用性。此前的研究集中在微颗粒/纳米颗粒，例如聚苯乙烯胶乳，二氧化硅和三聚氰胺甲醛，和生物相容性更高的模板，例如碳酸钙，聚（D，L-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）平面模板，以及生物细胞。酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（SPARC;也称为骨连接素）是调节细胞和细胞外基质之间的相互作用和细胞迁移的钙结合胞外基质糖蛋白。SPARC的表达增加与组织疤痕及纤维化之间有很强的相关性。在纤维化疾病中观察到SPARC的表达增加，且以SPARC表达为标靶来调节纤维化已被评价为一种潜在的治疗方法。纤维化是细胞外基质（ECM）的分泌和沉积，是各种疾病，如高血压，糖尿病，肝硬化和炎症过程的常见结果。在纤维化中，存在SPARC表达增加，表明SPARC蛋白质参与调节细胞外基质的相互作用。SPARC的表达和向上调节已在人体组织和​​动物模型中的多种类型的纤维化中得到报告。研究人员已经证明，SPARC表达抑制能够降低涉及皮肤、肝、肾、肺、肠纤维化和青光眼中的纤维化。Seetetal(PLoSOne,2010,5,9415)报告，SPARC的减少提高了眼部瘢痕形成的外科手术小鼠模型中的手术成功率。因此，SPARC靶向表达已被看作是用于创伤调控和降低瘢痕形成的一种潜在的治疗策略，因为SPARC向下调节还使得细胞迁移延迟，降低胶原收缩性，并降低促纤维化基因和促炎性基因的表达(Seetetal.,J.Cell.Mol.Med.2012,16,1245)。酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白（SPARC）的蛋白质表达增加与组织疤痕形成和纤维化相关，而SPARC抑制可以减少疤痕形成。因此，以SPARC为标靶的siRNA是抑制SPARC，减少疤痕形成的一种有潜力的方法。其困难在于，将具有生物活性的SPARCsiRNA递送到损伤部位。
技术实现思路
在本专利技术的第一个方面中，通过提供以下内容来满足向标靶位点递送完整RNA的方法的要求：用于将RNA递送至细胞的多层纳米颗粒，所述纳米颗粒包括：核心纳米颗粒，其以交替的带正电荷和带负电荷的聚合物层包覆，其中所述层的数目为2个或以上，且其中所述带负电荷的聚合物层中的至少一个包括RNA或由其组成。本专利技术的又一方面涉及用于制备根据本申请所述的多层纳米颗粒的方法，包括以下步骤：a.提供纳米颗粒核心；b.令所述纳米颗粒核心与带正电荷或带负电荷的聚合物接触，以在所述纳米颗粒核心上形成第一聚合物层；c.令步骤b得到的被包覆的纳米颗粒与带有与步骤b使用的所述聚合物相反电荷的聚合物接触，以在所述纳米颗粒上形成第二聚合物层；d.任选地，重复步骤b和c，其中所述带负电荷的聚合物层中的至少一个包括RNA或由其组成。本专利技术的又一方面涉及用于向细胞或生物体递送RNA（siRNA）的方法，包括：令所述细胞或生物体与有效剂量的根据本申请所述的多层纳米颗粒接触。本专利技术的又一方面涉及用于对对象的RNA治疗的疾病或紊乱进行治疗的方法，包括：用有效剂量的根据本申请所述的多层纳米颗粒向所述对象给药。本专利技术的又一方面涉及本申请所述的多层纳米颗粒用于向细胞或生物体递送RNA的用途。本专利技术还涵盖如本申请所述用于治疗RNA治疗的疾病或紊乱的多层纳米颗粒。本领域技术人员通过阅读如下附图和各种非限制性实施例的描述，将能够明白本专利技术的其他方面。附图说明附图不一本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于将RNA递送至细胞的多层纳米颗粒，所述纳米颗粒包括：核心纳米颗粒，其以交替的带正电荷和带负电荷的聚合物层包覆，其中所述层的数目为2或以上，且其中所述带负电荷的聚合物层中的至少一个包括RNA或由其组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.13 US 61/915,7901.用于将RNA递送至细胞的多层纳米颗粒，所述纳米颗粒包括：核心纳米颗粒，其以交替的带正电荷和带负电荷的聚合物层包覆，其中所述层的数目为2或以上，且其中所述带负电荷的聚合物层中的至少一个包括RNA或由其组成。2.根据权利要求1所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述RNA选自核糖酶、RNAi和siRNA。3.根据权利要求1或2所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒核心具有生物兼容性或生物降解性。4.根据权利要求1-3中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒核心包括选自以下的材料或由选自以下的材料组成：羟基磷灰石、二氧化硅、聚（丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）、聚（乳酸）（PLA）、碳酸钙、金、聚苯乙烯胶乳，优选为羟基磷灰石。5.根据权利要求1-3中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒核心包括脂质体。6.根据权利要求1-5中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒核心带负电荷。7.根据权利要求1-6中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述多层纳米颗粒包括3至10层。8.根据权利要求1-7中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述聚合物层的最外层为带正电荷的聚合物层。9.根据权利要求1-8中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述聚合物层的最内层为带正电荷的聚合物层。10.根据权利要求1-9中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述多层包括至少2个包括RNA或由其组成的带负电荷的聚合物层。11.根据权利要求10所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所有的所述带负电荷的聚合物层包括RNA或由其组成。12.根据权利要求1-11中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述带负电荷的聚合物层包括RNA或由其组成，或每个包括RNA或由其组成的带负电荷的聚合物层夹在两个带正电荷的聚合物层之间。13.根据权利要求1-12中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述带正电荷的聚合物层为聚阳离子。14.根据权利要求1-13中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述带负电荷的聚合物层为聚阴离子。15.根据权利要求1-14中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述带正电荷的聚合物层包括聚L-精氨酸或由其组成。16.根据权利要求1-15中任一项所述的多层纳米颗粒，其特征在于，所述带负电荷的聚合物层包括硫酸葡聚糖或由其组成。17.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·文卡特拉曼，黄斯伶，比约恩·内乌，
申请(专利权)人：南洋理工大学，新加坡保健服务集团有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡,SG