一种大豆蛋白的应用及其制备方法和表达载体、引物技术

本发明专利技术公开一种大豆蛋白的应用及其制备方法和表达载体、引物，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，将所述大豆蛋白用于制备冻存蛋白类生物制品的保护剂。该大豆蛋白为植物性蛋白，对蛋白类生物制品，尤其是酶类制品，起到很好的保护作用。

【技术实现步骤摘要】
一种大豆蛋白的应用及其制备方法和表达载体、引物
本专利技术涉及生物
，主要涉及一种大豆蛋白的应用及其表达载体和制备方法。
技术介绍
牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，现有技术多使用添加BSA(牛血清白蛋白)来保护蛋白类生物制品。例如在westernblot中作为Blockingagent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。但是BSA来源于动物，存在一定的使用风险，在碱性环境下很容易被被蛋白酶水解，同时因为具有多个酶切位点，所以很容易形成多种不同大小的多肽片段，可能导致目的蛋白纯度下降，并且具有潜在的血源性病原体污染，应用中并不安全。因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种大豆蛋白的应用及其表达载体和制备方法，旨在解决现有BSA用于保护蛋白类生物制品存在风险的问题。本专利技术的技术方案如下：一种大豆蛋白的应用，其中，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，将所述大豆蛋白用于制备冻存蛋白类生物制品的保护剂。所述的大豆蛋白的应用，其中，所述冻存蛋白类生物制品为酶制剂。一种大豆蛋白的制备方法，其中，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，其制备方法包括以下步骤：扩增目的基因：以F：3’-ATGGCGAGCGCAGTGGAGAAG-5’；R：3’-TCAGCTCTCGTGAGTGCCATTC-5’作为引物，以大豆R0期胚根cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因片段，目的基因片段的基因序列如SEQIDNO.4所示；构建重组质粒：将目的基因片段与经NdeI和XhoI双酶切的蛋白表达载体PET-28a，通过T4连接酶连接酶切产物，构建pET-28a重组质粒；转化感受态细胞：将pET-28a重组质粒转化大肠杆菌BL21Star感受态细胞；诱导表达：将含有pET-28a重组质粒的菌株扩大培养，加入1‰IPTG贮存液过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集，重悬，破碎菌体，离心，取上清液，得总可溶性蛋白；蛋白分离纯化：对所得的总可溶性蛋白进行亲和层析，分离纯化目的蛋白。所述的大豆蛋白的制备方法，其中，构建重组质粒过程中，包括以下步骤：将目的基因片段和经过双酶切的PET-28a蛋白表达载体按照摩尔比10:1混合，加入0.5μLT4连接酶，1μL10×Buffer，用水补齐至10μL，16℃连接过夜。所述的大豆蛋白的制备方法，其中，诱导表达过程中，包括以下步骤：将含有pET-28a重组质粒的菌株扩大培养，加入1‰IPTG贮存液，在16℃下150rmp过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集，用BalanceBuffer重悬，破碎菌体，在4℃，10000rmp下离心30min，取上清液。所述的大豆蛋白的制备方法，其中，蛋白分离纯化过程中，包括以下步骤：将总可溶性蛋白经镍离子亲和层析，利用蛋白脱盐柱去除蛋白溶液中的咪唑，将脱盐后的蛋白溶液冷冻干燥，用PBS缓冲液复溶，用分子筛分离纯化凝血酶酶切产物。一种用于制备大豆蛋白的引物，其中，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，引物的序列如下所示：F：3’-ATGGCGAGCGCAGTGGAGAAG(NdeI)-5’；R：3’-TCAGCTCTCGTGAGTGCCATTC(XhoI)-5’。一种用于制备大豆蛋白的表达载体，其中，所述表达载体为携带有SEQIDNO.4所示的大豆蛋白基因，用于表达基因编码为Glyma06g25310.1的大豆蛋白。所述的用于制备大豆蛋白的表达载体，其中，所述表达载体用PET-28a蛋白表达载体重组得到，该大豆蛋白基因通过酶切位点NdeI和XhoI连接在表达载体上。有益效果：大豆热稳定蛋白有许多生物学功能特性，近来的研究发现，在胁迫条件(如干旱、高温、冷冻等)下，其可以提高蛋白抵抗逆境能，能够对生物膜和蛋白质等生物大分子发挥良好的保护作用。大豆蛋白属于植物，安全性较高，如果投入到生产应用中，能够较好解决蛋白类产品在运输过程中经冷冻胁迫活性降低的问题。附图说明图1为本专利技术实施例1中利用PCR扩增大豆基因片段的电泳结果图(M为DL2000Marker)。图2为本专利技术实施例1中利用菌落PCR验证重组菌的电泳结果图(M为DL2000Marker)。图3为本专利技术实施例5中17号蛋白的诱导表达的电泳结果图。图4为本专利技术实施例7中17号蛋白的表达纯化的电泳结果图。图5为本专利技术实施例7中Western-blotting结果图。图6为本专利技术实施例8中不同溶液下蛋白二级结构的数据示意图。图7为本专利技术实施例9中LDH酶的残留酶活柱状图。具体实施方式本专利技术提供一种大豆蛋白的应用及其表达载体和制备方法，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术所提供的一种大豆蛋白的应用，是将所述大豆蛋白用于制备冻存蛋白类生物制品的保护剂。其中，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1。所述冻存蛋白类生物制品可以为酶制剂。所述大豆蛋白的基因序列(SEQIDNO.1)如下所示：ATCGAATCGACCTGAACTGCTTCTTCAAATTTTTTTCTGGTGATTCTACAACCTGTCCTAACTCTCAACCCTCTTCCTCTTAATTAATCTATTCCTCTTTATCCTCCTCTGAACCTCAAACACCAAAACAAAGCATTACAATTCTCAATTTCACATAAACACCAGAATTGATAAAAACACATAACAAAAAAAAAAAGTGAAAAATGGCGAGCGCAGTGGAGAAGGAGGGTGGCGCGAGCGAGGAAACTTTGTCTTTGGAGCTTCCTGCTCCACCTGGTTGGAAGAAGCAGTTCATTCCAAAGAAAGCTGGTACCCCAAAGAAAAACGAGATTGTGTTCACTGCACCAACAGGAGAGGAGATCAATAACAGGAAGCAGCTGGAAAAATATTTGAAAGCACACCCTGGAGGCCCAGCTGTATCAGAATTTGACTGGGGCACTGGTGAGACCCCAAGAAGATCTACAAGAATCAGTGAGAAGGCCAAGGCAGCTCCTCCAACACAGAGGGAGCCCCCAAAGAAGCGTACTAAAAGATCATCAGCTTCACAAAAGGAAATTTCCCAGGAAGAAAAAGAAGAGGAGACCAAGGAAGCAGAGATGCAAGAAGCTGATGACACCACTAAGGGTGATAATGATATAGAGAAGGAAAAGGTTGTTGTAAACGAAAATCATGACAAGAGTGTGGAAGATACAGATGTCAACAAATCCACTCGTTATGGAGAAGAAGCTAAAGCTGGAGAAAACGTTGAGGTACCTATTGAAGAGGAAAAATCCAATGCTGCTGATGGAGAAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大豆蛋白的应用，其特征在于，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，将所述大豆蛋白用于制备冻存蛋白类生物制品的保护剂。

【技术特征摘要】
1.一种大豆蛋白的应用，其特征在于，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，将所述大豆蛋白用于制备冻存蛋白类生物制品的保护剂。2.根据权利要求1所述的大豆蛋白的应用，其特征在于，所述冻存蛋白类生物制品为酶制剂。3.一种大豆蛋白的制备方法，其特征在于，所述大豆蛋白的基因编码为Glyma06g25310.1，其制备方法包括以下步骤：扩增目的基因：以F：3’-ATGGCGAGCGCAGTGGAGAAG-5’；R：3’-TCAGCTCTCGTGAGTGCCATTC-5’作为引物，以大豆R0期胚根cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因片段，目的基因片段的基因序列如SEQIDNO.4所示；构建重组质粒：将目的基因片段与经NdeI和XhoI双酶切的蛋白表达载体PET-28a，通过T4连接酶连接酶切产物，构建pET-28a重组质粒；转化感受态细胞：将pET-28a重组质粒转化大肠杆菌BL21Star感受态细胞；诱导表达：将含有pET-28a重组质粒的菌株扩大培养，加入1‰IPTG贮存液过夜诱导，将诱导后的菌体离心收集，重悬，破碎菌体，离心，取上清液，得总可溶性蛋白；蛋白分离纯化：对所得的总可溶性蛋白进行亲和层析，分离纯化目的蛋白。4.根据权利要求3所述的大豆蛋白的制备方法，其特征在于，构建重组质粒过程中，包括以下步骤：将目的基因片段和经过双酶切的PET-28a蛋白表达载体按照摩尔比10:1混合，加入0.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昀，孙楠，郑易之，吴佳辉，程华，谭芳美，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44