一种从土壤中特异性分离酸杆菌的方法技术

本发明专利技术将现代分子生物学技术与传统的微生物学培养技术相结合，基于门水平上的特异性引物‑PCR结合改良后的基本培养基平板特异性分离得到传统意义上难培养的酸杆菌的方法。方法为，将样品悬浊液稀释涂布到改良后的基本培养基平板，选择白色单菌落继续采用连续划线平板法纯化，将纯化后的单菌落经液体培养基扩大培养，提取基因组DNA，应用酸杆菌门特异性引物PCR扩增16S rDNA片段，若得到片段大小为1462的阳性扩增产物，即表明筛选得到该样品中的酸杆菌。采用本发明专利技术中的门特异性引物扩增结合酸性筛选平板法可以有效地从样品中分离得到可培养地酸杆菌。

【技术实现步骤摘要】
一种从土壤中特异性分离酸杆菌的方法
本专利技术涉及的领域为现代分子生物学技术和微生物技术的交叉领域，具体的说为一种基于特异性引物-PCR结合改良后的基本培养基平板特异性分离酸杆菌的方法。
技术介绍
酸杆菌(Acidobacteria)最初的发现是由日本的Kishimoto等于1991年发现，酸杆菌作为土壤微生物群落中的重要组成部分，其相对丰度仅次于土壤中的变形菌门，约占土壤细菌总量的20～50％，而在某些特定环境中，如栗树根际土壤中，作为土壤中的绝对优势微生物类群，其相对丰度可达到65％。酸杆菌门在环境的分布极为广泛，包括自然环境以至于一些极端环境与污染环境，而且酸杆菌在驱动土壤物质循环和生态环境构建过程当中具有重要的生态学意义。近几年的研究发现根据系统发育研究结果可以将酸杆菌下分为27种不同纲水平微生物。对土壤微生物宏基因组测序表明，酸杆菌具有降解植物中纤维素相关基因，以此推测在环境较为恶劣的情况下，如酸性、低温环境中，相比于其他微生物，对恶劣环境强适应性的酸杆菌所具备的纤维素降解能力就尤为突出；酸杆菌对于所处生境中的铁元素循环也起到积极作用，如可在葡萄糖发酵过程中形成Fe(Ⅱ)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从土壤中特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：其为基于门水平上的特异性引物‑PCR结合改良后的基本培养基平板从土壤中特异性分离酸杆菌，将待处理土壤样品悬浊液涂布于pH为3.5～4.5的基本培养基固体平板培养，选择白色单菌落继续采用连续划线平板法纯化，将纯化后的单菌落经液体培养基扩大培养，提取细菌基因组DNA，应用酸杆菌门特异性引物PCR扩增16S rDNA片段，若得到片段大小为1462bp的阳性扩增产物，即表明筛选得到该样品中的酸杆菌；酸杆菌门特异性引物Acido_31F：5‘‑GATCCTGGCTCAGAATC‑3’，Acido_1492R：5‘‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3...

【技术特征摘要】
1.一种从土壤中特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：其为基于门水平上的特异性引物-PCR结合改良后的基本培养基平板从土壤中特异性分离酸杆菌，将待处理土壤样品悬浊液涂布于pH为3.5～4.5的基本培养基固体平板培养，选择白色单菌落继续采用连续划线平板法纯化，将纯化后的单菌落经液体培养基扩大培养，提取细菌基因组DNA，应用酸杆菌门特异性引物PCR扩增16SrDNA片段，若得到片段大小为1462bp的阳性扩增产物，即表明筛选得到该样品中的酸杆菌；酸杆菌门特异性引物Acido_31F：5‘-GATCCTGGCTCAGAATC-3’，Acido_1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。2.根据权利要求1所述的特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：1)土壤悬浊液的制备：首先称取5g待处理土壤至于已灭菌的锥形瓶并添加玻璃珠，而后向其中加入40－50ml生理盐水于150－180rpm条件下振荡80－100min，使土壤微生物充分溶于生理盐水中；振荡结束后，于室温下静置20－40min，采用生理盐水对静置后的土壤上清液进行稀释，浓度范围为原上清液体积浓度的10-3－10-6(稀释度以10-4为宜)；2)涂布样液至改良后的固体基本培养基：吸取上一步中得到的稀释后的样液，采用涂布平板法涂布，于30℃下培养3～6天；3)连续划线平板法纯化：接种环挑取上一步中得到的单菌落，在改良后的固体基本培养基平板上连续划线培养以达到分离纯化的目的；4)纯培养菌株基因组DNA的提取：将步骤3)中分离纯化后得到的单菌落接种于改良后的液体基本培养基，30℃下150-180rpm振荡培养过夜，而后依次采用溶菌酶破坏细菌细胞壁、蛋白酶K去除蛋白质影响和氯仿/异戊醇提取纯培养菌株的基因组DNA；5)特异性引物扩增纯菌株的16SrDNA片段：采用特异性引物Acido_31F：5‘-GATCCTGGCTCAGAATC-3’，Acido_1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，以步骤4)中提取得到的纯培养菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增；扩增后的产物经由质量浓度2％的琼脂糖凝胶电泳检测，若成功得到阳性PCR产物且扩增片段大小为1462bp，即可证明筛选得到酸杆菌。3.按权利要求2所述的特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：改良后的固体基本培养基配方为:KH2PO41.5g，MgSO47H2O0.2g，蔗糖30g，酵母提取物50mg，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1000ml，采用1mol/L的HCL溶液调节pH至3.5-4；改良后的液体基本培养基配方为:KH2PO41.5g，MgSO47H2O0.2g，蔗糖30g，酵母提取物50mg，用蒸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，姚飞，杨山，王志瑞，姜勇，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21