一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用。Fab抗体包括轻链和重链，所述重链具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；所述轻链具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。本发明专利技术提供的Fab抗体与抗原的结合可被游离的半抗原竞争性抑制，IC50为135.7ng/mL，具有很好的抗原结合活性。通过标准曲线可知线性检测范围分别在7.2～861.7 ng/mL之间。

【技术实现步骤摘要】
一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用
本专利技术涉及食品安全免疫检测
，具体地，涉及一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体及制备方法和应用。
技术介绍
我国是农业大国，同时也是农药生产与使用大国。有机磷是当今农药中主要类别之一，其应用几乎遍及了整个农药领域。当今，市面上有机磷农药商品不胜枚举，特别在杀虫剂方面，有机磷类农药的使用量也是长年鳌居首位。然而，农药是一把“双刃剑”。全世界因有机磷农药急性中毒引起的死亡每年超过20万人，而由于长期低剂量接触有机磷农药而引起的肿瘤、生殖毒性及神经毒性等潜在中毒人数无法估计。尽管一些高毒的有机磷农药(如对硫磷等)的使用已经被明令禁止，但是在农产品及环境中仍有残留，此外，一些中低毒的有机磷农药(如三唑磷、毒死蜱和治螟磷等)作为高毒农药替代品正在农业生产中广泛应用。近几年卫生部对市面所售叶类蔬菜进行卫生监督抽查，结果显示，有机磷等禁用农药仍然是叶类蔬菜抽检不合格的主要原因。农药残留问题不仅仅危害到国内民众的健康，还会影响我国在国际贸易中的地位和形象。在国际市场上，日趋严格的农药残留标准已成为发达国家或农产品进口国重要的技术贸易壁垒手段，然而，在我国趋于恶化的农产品农药残留问题已成为制约农产品贸易的首要因素之一，据统计，因有机磷农药多残留问题每年给我国的农产品贸易都带来了巨额的经济损失。为保证居民健康诉求，避免农药残留技术壁垒对我国农产品出口的影响，加强对此类农药的检测十分必要。目前国内外检测有机磷农药的常用方法主要集中在仪器方法如高效液相色谱-质谱联用等方法以及酶抑制法，这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。而酶抑制法技术具有快速、简便、低成本等特点，特别适合现场大批样品的筛选检测，易于推广普及。但是稳定性较差、性能差异性较大的酶制剂导致其准确度和可靠性均不太理想，无法满足日趋严格的残留限量标准。基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作简单、快速、灵敏、高通量等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。随着人们对抗体基因结构与功能的深入了解和分子生物学技术的发展及向各学科渗透，小分子有害物的特异性抗体制备正在朝着第三代抗体——基因工程抗体的方向发展。基因工程抗体最显著的优势之一在于其分子量小，易于获得抗体蛋白及其编码序列，因此可以在分子水平对其进行进化改造，实现抗体性能的可控性。基因工程抗体技术，是将对免疫球蛋白基因结构与功能的认识与DNA重组技术有机结合，在基因水平上对免疫球蛋白分子的基因片段进行重组后，转入真核或原核表达系统中表达，形成基因工程重组抗体。应用DNA重组和蛋白质工程技术可以按人们的意愿在基因水平上对抗体分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成新型抗体分子，并可赋予抗体分子新的生物学活性。Fab片段是将重链Fd(VH+CH1)段基因与完整的轻链基因5’端接上细菌的信号序列，所表达的蛋白在细菌信号肽的引导下可分泌到周质腔，信号肽被信号肽酶所裂解，生成的Fd段和轻链在周质腔中完成立体折叠和链内链间二硫键形成异二聚体，成为有功能的Fab。这种小分子抗体具有抗体的活性，而大小为完整抗体的三分之一。目前，还没有针对二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药(DPPS)的Fab抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体。本专利技术的另一个目的是提供一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的制备方法。本专利技术的在一个目的是提供一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体，包括轻链和重链，所述重链具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，或具有SEQIDNO:1所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQIDNO:1所示序列具有相同功能的氨基酸序列；所述轻链具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或具有SEQIDNO:2所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQIDNO:2所示序列具有相同功能的氨基酸序列。一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体，包括轻链和重链，所述重链具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，或具有SEQIDNO:3所示序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸但与SEQIDNO:3所示序列具有相同功能的核苷酸序列；所述轻链具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，或具有SEQIDNO:4所示的序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸但与SEQIDNO:4所示序列具有相同功能的核苷酸序列。一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的制备方法，包括如下步骤：将SEQIDNO:3所示的重链和SEQIDNO:4所示的轻链与载体质粒连接并进行鉴定之后，转化受体菌株，筛选阳性重组受体菌株，经表达优化后，获得抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体。作为优选实施方案，所述载体质粒为pComb3XSS质粒，所述受体菌株为大肠杆菌TOP10F’。更优选地，所述阳性重组大肠杆菌TOP10F’的表达优化条件为IPTG诱导浓度为0.1～0.2mM，表达温度为18～20℃，表达时间为10～14h。最优选地，所述阳性重组大肠杆菌XL1-Blue的表达优化条件为IPTG诱导浓度为0.1mM，表达温度为18℃，表达时间为12h。最优选地，一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体的制备方法，包括如下步骤：如上所述的抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体在检测二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药中的应用。本专利技术提供的Fab抗体可以用于检测所有含有二乙氧基硫代磷酸醋共有结构的有机磷农药，优选地，所述二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药为蝇毒磷、对硫磷、除线磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷、伏杀硫磷、甲拌磷、毒死蜱、乙基溴硫磷、治螟磷、氯唑磷、二嗪磷或乙基嘧啶磷中的一种或多种。优选地，所述检测的具体技术手段可以是酶联免疫分析法或其他分析方法。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术制备的基因工程抗体是针对抗DPPS的单克隆抗体的抗原结合片断；本专利技术建立的ELISA检测方法是的基于Fab基因工程抗体的同时检测DPPS多残留的ELISA检测方法，可实施大量样品的快速检测筛选，降低成本。本专利技术的Fab抗体保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的功能性抗体片段，具有较高稳定性和灵敏度，可通过基因工程技术体外表达得到，可在细菌中很经济的大规模生产，避免单克隆细胞阳性丢失风险。附图说明图1为pComb3XSS-Fab噬粒载体构建示意图。图2为pComb3XSS噬粒载体图。图3为icELISA测定Fab抗体标准曲线。图4为Fab抗体三维同源建模模型图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体，其特征在于，包括轻链和重链，所述重链具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO :1所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQ ID NO :1所示序列具有相同功能的氨基酸序列；所述轻链具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO :2所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQ ID NO :2所示序列具有相同功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗体，其特征在于，包括轻链和重链，所述重链具有SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，或具有SEQIDNO:1所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQIDNO:1所示序列具有相同功能的氨基酸序列；所述轻链具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或具有SEQIDNO:2所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与SEQIDNO:2所示序列具有相同功能的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的Fab抗体，其特征在于，所述重链具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，或具有SEQIDNO:3所示序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸但与SEQIDNO:3所示序列具有相同功能的核苷酸序列；所述轻链具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，或具有SEQIDNO:4所示的序列经缺失、取代或添加一个或多个核苷酸但与SEQIDNO:4所示序列具有相同功能的核苷酸序列。3.一种抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的Fab抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振林，陈子键，雷红涛，刘辉，王弘，孙远明，杨金易，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44