一株猪源罗伊氏乳杆菌及其制备的固态益生菌剂制造技术

本发明专利技术介绍一种猪源罗伊氏乳杆菌及其制备的固态益生菌剂。菌株分离于健康生猪新鲜粪便，经形态生理生化及分子生物学方法鉴定为Lactobacillus reuteri YSJL‑12，保存编号CGMCC No.9062。该菌株抑制Listeria monocytogenes CICC21633呈阳性。所制固态益生菌剂含有豆粕和活性Lactobacillus reuteri YSJL‑12，添加到生猪基础饲料中，可以替代金霉素防治腹泻，所饲养肉猪日龄28～168的料肉比为2.61。菌剂具有宿主特异性强、活菌数量多、成本价格低、性价比高等特点，可增加高温豆粕附加值，降低绿色生猪养殖成本。

A Lactobacillus Lactobacillus from pig origin and a solid probiotic bacteria preparation prepared by the same

The present invention relates to a Lactobacillus lactobacillus of pig origin and a solid probiotic bacteria preparation prepared by the same. Strains were isolated from healthy pig feces identified by morphological and physiological biochemical and molecular biological methods for Lactobacillus reuteri YSJL 12, No. CGMCC No.9062 preservation. The inhibition of Listeria monocytogenes strains were positive for CICC21633. The solid probiotic agent containing soybean meal and the activity of Lactobacillus reuteri YSJL 12, added to the pig based feed, can substitute for the prevention and treatment of diarrhea by aureomycin, raised pork age 28 ~ 168 feed meat ratio is 2.61. The microbial inoculum has the characteristics of strong host specificity, large number of live bacteria, low cost, high cost performance and so on. It can increase the added value of high temperature soybean meal and reduce the cost of green pig breeding.

【技术实现步骤摘要】
一株猪源罗伊氏乳杆菌及其制备的固态益生菌剂
本专利技术涉及分离的一株猪源罗伊氏乳杆菌及利用其制备的可替代金霉素的饲用益生菌剂，属于饲料添加剂领域。
技术介绍
饲料中添加抗生素已成当今世界养殖业普遍存在的事实，从短期效应看，添加抗生素的饲料的确可抑制饲喂动物的腹泻，杀灭肠道中致病菌，但同时也破坏动物肠道正常菌群平衡。从长远角度看，长期使用抗生素，会使肠道中的致病菌产生抗药性，造成杀灭致病菌的抗生素剂量逐渐增大，抗生素的残留风险加大，最终导致人类患病时无药可施。因此，选择不产生抗药性的、替代抗生素的制剂已成为饲料行业研究的趋势和热点。作为替代抗生素的益生菌剂至少应具备以下条件：1.菌株及其代谢产物对宿主无害；2.菌株具有宿主特异性；3.菌株具有杀灭肠道致病菌的性能且稳定；4.菌株可通过适当条件扩大繁殖，且生产成本可以接受。罗伊氏乳杆菌是美国联邦食品药品管理局(FDA)、美国饲料控制官员协会(AAFCO)和我国农业部公布的可用于饲料添加剂的菌种之一。罗伊氏乳杆菌(Lactobicillusreuteri)是目前存在于几乎所用脊椎动物和哺乳动物肠道中的天然宿主乳酸菌，对其益生性的研究始于上世纪80年代，且至今对其的研究仍然不断。现已发现，罗伊氏乳杆菌可承受胃酸和胆汁的作用抵达小肠上部，并与小肠上皮细胞紧密地黏附，是具有较强肠道黏附性的乳酸菌。罗伊氏乳杆菌可产生一种非蛋白类广谱抑菌物质-罗伊氏菌素，由3-羟基丙醛、3-羟基丙醛水合物和3-羟基丙醛二聚体构成，可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌及原生动物的生长，尤其是肠道致病菌大肠杆菌、沙门氏杆菌、志贺氏菌、李斯特菌等。罗伊氏乳杆菌还能通过刺激动物机体的淋巴细胞的增生来提高机体抗感染能力，可维持免疫缺陷的小鼠肠道粘膜完整性、提高机体免疫力具有明显促进作用。OuwehandAC等人研究罗伊氏乳杆菌104R表明该菌株既可以黏附于猪回肠的黏液层，又能分泌抑制产肠毒素大肠杆菌K88肠道定植的抑菌物质。Blanchard等人完成了添加罗伊氏乳杆菌、抗生素和无添加的对照组比对试验，发现在仔猪断奶前上述三种饲喂方式无明显差别；但在断奶后的试验中，添加罗伊氏乳杆菌试验组表现出较高的生长速率和更洁净的生长状态，综合各项指标，添加罗伊氏乳杆菌组和抗生素组的效果相同，均优于对照组。由此说明，添加罗伊氏乳杆菌可起到替代抗生素的作用。目前，罗伊氏乳杆菌的培养多见于合成培养基MRS，华侨大学的陈国等人在此基础上简化了培养基组分：酵母膏质量浓度20g/L，葡萄糖质量浓度20g/L，醋酸钠质量浓度7g/L，柠檬酸铵质量浓度1g/L，磷酸氢二钾质量浓度3g/L，硫酸镁质量浓度0.2g/L，硫酸锰质量浓度为0.23g/L，吐温-80质量浓度1g/L，初始pH6.2，培养温度38.6℃，最终菌体质量浓度达0.984g/L。但就此仍满足不利工业化生产培养基廉价的基本要求。豆粕是有机溶剂提油后的副产物，虽然豆粕蛋白质44％-48％，但鉴于当前制油企业追求高出油率，其制油副产物多为高温豆粕，蛋白质变性程度高，作为蛋白质来源直接饲喂消化利用率低，浪费严重。利用粮油副产物制备替代抗生素的罗伊氏乳杆固态菌剂，有效降低罗伊氏乳杆菌剂制备成本，为生产无抗生素残留的绿色畜禽肉制品提高保障，促进养殖业的健康发展。
技术实现思路
本专利技术涉及自主分离筛选的猪源罗伊氏乳杆菌菌株及其制备的抑制肠道致病菌益生菌剂。目前生猪养殖业的益生菌剂虽然种类繁多，但大多缺乏宿主特异性，菌剂活菌数量偏低，价格偏高，应用效果不理想。而益生菌菌剂的宿主特异性、活菌数量高效性、生产原料廉价性均是影响益生菌剂应用效果的主要因素，也是衡量饲料益生菌剂工业化生产是否可行的重要指标。本专利技术旨在获得源自猪源的肠道天然宿主菌罗伊氏乳杆菌菌株，以其为菌种，获得宿主明确、应用效果显著、成本低廉、可替代金霉素的罗伊氏乳杆菌固态菌剂，应用于生猪的绿色养殖中。本专利技术一株猪源罗伊氏乳杆菌及其制备的固态益生菌剂包括以下步骤：(1)一株猪源LactobacillusreuteriYSJL-12分离于新鲜健康猪源粪便；(2)以该菌株制备的固态益生菌剂含有豆粕和活性LactobacillusreuteriYSJL-12；(3)以1％～2％比例添加到生猪基础饲料中，可以替代金霉素防治腹泻；(4)所饲养肉猪日龄28～168的料肉比为2.61。步骤(1)中所述罗伊氏乳杆菌菌株LactobacillusreuteriYSJL-12，保存编号CGMCCNo.9062，保藏日期2014年4月16日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。步骤(1)中，LactobacillusreuteriYSJL-12抑制ListeriamonocytogenesCICC21633呈阳性。步骤(2)中，LactobacillusreuteriYSJL-12固态菌剂活菌计数≥1×109cfu/g(绝干)。步骤(2)中，该固态益生菌剂制备步骤包括：(a)在发酵培养基中接入LactobacillusreuteriYSJL-12种子液，置于不锈钢发酵罐37℃静置培养72小时；(b)将发酵72h发酵液搅拌均匀，无菌条件下，按1:1比例喷洒或混合于高温变性豆粕干粉，让豆粕粉充分吸收LactobacillusreuteriYSJL-12菌液，然后加入干燥温度≤30℃的真空低温沸腾干燥机干燥至水分6％以下。步骤(2)的(a)中，发酵培养基为高温变性豆粕2％～5％，葡萄糖6％～8％，碳酸钙1％，玉米蛋白粉0.25％，无水乙酸钠1.5％，柠檬酸三铵0.3％，硫酸镁0.3％，磷酸氢二钾0.3％，硫酸锰0.0075％。步骤(2)的(b)中，高温变性豆粕粉碎后过40目筛，装入灭菌袋密封后121℃高压灭菌30min，冷却室温。本专利技术兼顾了益生菌剂的应用效果和制备成本，利用高温变性豆粕为原料制备的猪源LactobacillusreuteriYSJL-12固态菌剂应用宿主针对性强，菌剂罗伊氏乳杆菌活菌数高，产品生产成本低，可操作性强，贮存运输方便。该菌剂可以替代常规饲料中普遍添加的抗生素金霉素，有效避免猪肉中抗生素的残留，饲喂的生猪生长快，料肉比低，同时有效改善生猪养殖的恶臭环境。相比已有饲料益生菌剂，本专利技术菌剂的性价比更高。该菌剂的应用可增加高温豆粕附加值，降低绿色生猪养殖成本，促进绿色无抗生猪养殖业的健康发展，创造良好的经济效益和社会效率。附图说明图1工艺流程图图2LactobacillusreuteriYSJL-12菌落平板图3LactobacillusreuteriYSJL-12光学显微镜下菌体形态(革兰氏染色)图4LactobacillusreuteriYSJL-12扫描电镜下菌体形态图5LactobacillusreuteriYSJL-1216SrDNA与LactobacillusreuteristrainZJ62216SrDNA比对结果具体实施方式具体实施方式一:菌株的分离筛选产酸菌株的分离筛选：取适量健康母猪新鲜粪便加入无菌容器，立即密封，冰镇条件下带回实验室。无菌条件下，取上述新鲜粪便少许加入带玻璃珠的无菌水三角瓶中，摇匀，取1mL加入9mL无菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株猪源罗伊氏乳杆菌及其制备的固态益生菌剂，其特征在于以下步骤：(1)一株猪源Lactobacillus reuteri YSJL‑12分离于新鲜健康猪源粪便；(2)以该菌株制备的固态益生菌剂含有豆粕和活性Lactobacillus reuteri YSJL‑12；(3)以1％～2％比例添加到生猪基础饲料中，可以替代金霉素防治腹泻；(4)所饲养肉猪日龄28～168的料肉比为2.61。

【技术特征摘要】
1.一株猪源罗伊氏乳杆菌及其制备的固态益生菌剂，其特征在于以下步骤：(1)一株猪源LactobacillusreuteriYSJL-12分离于新鲜健康猪源粪便；(2)以该菌株制备的固态益生菌剂含有豆粕和活性LactobacillusreuteriYSJL-12；(3)以1％～2％比例添加到生猪基础饲料中，可以替代金霉素防治腹泻；(4)所饲养肉猪日龄28～168的料肉比为2.61。2.权利要求1中所述方法，其特征在于：步骤(1)中所述罗伊氏乳杆菌菌株LactobacillusreuteriYSJL-12，保存编号CGMCCNo.9062，保藏日期2014年4月16日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，LactobacillusreuteriYSJL-12抑制ListeriamonocytogenesCICC21633呈阳性。4.根据权利要求1中所述方法，其特征在于：所述步骤(2)中，LactobacillusreuteriYSJL-12固态菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐速，江连洲，孙慧，许岩，穆莹，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23