一种芫花茎段外植体初代组织培养基制造技术

本发明专利技术公开了一种芫花茎段外植体初代组织培养基，包括如下组分：MS+0.1mg·L

A medium stem explant tissue of Daphne genkwa

The invention discloses a culture medium of genkwa stem explants of primary tissue, which comprises the following components: MS+0.1mg, L

【技术实现步骤摘要】
一种芫花茎段外植体初代组织培养基
本专利技术涉及植物初代组织培养，具体涉及一种芫花茎段外植体初代组织培养基。
技术介绍
芫花(DaphnegenkwaSieb.etZucc.)为瑞香科瑞香属落叶灌木，其花朵锦簇、花色艳丽，具有较高的观赏价值，为我国优良野生花卉资源。同时也是我国重要的中药材和生物农药。从20世纪60年代开始，尤其是90年代以后，芫花的生境遭到严重破坏，种群分布范围缩小，居群数量及个体数量急剧下降，其野生可利用资源逐渐减少。研究芫花的繁殖技术成为保护和利用该植物资源的迫切要求。芫花一般采用播种方法进行繁殖，但种子繁殖其后代性状发生分离，无法保持母本植株的优良性状。芫花的扦插繁殖，生根成活率低，加之穗源少，繁殖效率低，不能实现快速大量繁殖。采用组织培养方法繁殖芫花，可保持母本优良性状，为优良单株的快速扩繁提供途径。目前，关于芫花的研究主要集中在其化学组分及药理作用，以及生物农药的研究上，在繁殖、栽培技术的相关研究较少，其茎段外植体组织培养快繁技术在国内外尚未见报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种芫花茎段外植体初代组织培养培养基，使用该初代组织培养基对芫花茎段外植体进行初代组织培养，诱导其丛生芽，可以简单、快捷的获得芫花组培苗，培养周期明显缩短，培养成功率明显提高，并且萌芽率高，玻璃化率低。技术方案：为了实现上述专利技术目的，如本专利技术所述一种芫花茎段初代组织培养基，包括如下组分：MS+0.1mg·L-1NAA+1.0-1.5mg·L-1ZT，加入蔗糖25-30g/L、琼脂6.5-7g/L，调整酸碱度至pH＝5.7-5.8。进一步地，所述的初代组织培养基，包括如下组分：MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT，加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L，调整酸碱度至pH＝5.8。所述初代组织培养基用于芫花茎段外植体的初代组织培养方法，包括如下步骤：(1)芫花外植体的选取：采集生长健壮，腋芽饱满，无病虫害的芫花当年生枝条，去除全部叶片，剪截成8～10cm带腋芽茎段作为外植体；(2)芫花外植体的处理：将外植体用洗衣粉溶液浸泡洗涤15～20min，接着用流水冲洗8～12小时。在无菌环境下将外植体剪成4-5cm茎段进行消毒处理；消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成1.5～2.5cm的长度，接入芫花茎段外植体初代组织培养的培养基中；(3)芫花外植体的培养：将步骤(2)接入初代培养基中的外植体置于培养室的培养架进行光照培养，直至诱导丛生芽萌发。其中，步骤(2)所述洗衣粉溶液(洗衣粉为市售的普通洗衣粉)质量体积比为0.2-0.5％，浸泡时间为15～20min，接着用流水冲洗8～12h。通常洗衣粉溶液浸泡时间为20min，流水冲洗时间为12h。芫花茎干表面密被短绒毛，直接进行消毒处理杀菌效果不理想。洗衣粉溶液可有效去除粘黏在茸毛上的污物，改善消毒效果；流水冲洗可进一步洗净粘黏在植物体表或绒毛上的污物，改善消毒效果。步骤(2)所述消毒为先采用体积百分比浓度为70～75％乙醇溶液进行消毒，再将茎段放入1g·L-1升汞加3-5滴吐温80的混合溶液浸泡消毒。进一步地，所述乙醇进行消毒的时间为30-45s，升汞加吐温80混合溶液的浸泡消毒时间为10～14min。吐温80为表面活性剂，可以湿润外植体表面组织，促进杀菌剂充分接触外植体表面组织，达到较好的消毒效果。其中，步骤(3)所述光照培养的温度22～25℃，光照强度2000～3000lx，相对湿度70-75％，光周期14h昼/10h夜。步骤(3)所述光照培养的时间25-30d。本专利技术所用的培养基和试剂都由市售可得。本专利技术所用外植体为芫花当年生枝条，去除叶片，剪截成带腋芽茎段其优势在于：1.茎段外植体个体较大，消毒、清洗、剪切等试验操作方便易行；2.茎段外植体对消毒试剂具有较强耐受能力，消毒致死率低，较其他方法更易获得无菌试管苗。3.使用茎段外植体诱导丛生芽与愈伤组织诱导丛生芽的方法相比，其诱导丛生芽的萌发仅需打破腋芽休眠，而无须经历脱分化与再分化过程，因而成功率较高，其培养周期也明显缩短。如果采用芫花其他部位为外植体(例如腋芽)，脱分化诱导愈伤组织，然后再分化形成丛生芽的方法进行初代培养。其缺点在于芫花腋芽极小(直径在1mm以下)，其采集、剪切、夹取等操作不便；萌动的腋芽外植体组织幼嫩，对消毒剂耐受程度低，消毒致死率高。外植体采用脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成丛生芽的过程成功率低，过程耗时长。脱分化形成愈伤组织过程通常需1-2个月或更长时间；愈伤组织再分化形成丛生芽过程通常还需1-2个月或更长时间。且植物体细胞具有全能性为理论特性，实际培养过程中体细胞能否表达其全能性为随机事件。有益效果：由现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术使用的芫花茎段外植体初代组织培养基对芫花茎段外植体进行培养，使得芫花茎段外植体萌芽率达到83.3％以上，玻璃化率低于22.3％，萌芽均高达到1.67cm以上。本专利技术使用芫花茎段初代组织培养基对芫花茎段外植体进行初代组织培养诱导丛生芽，可以简单、快捷的获得芫花组培苗。本专利技术采用茎段外植体诱导丛生芽与愈伤组织诱导丛生芽方法相比，其诱导无须经历脱分化与再分化过程，其培养周期明显缩短。本专利技术对芫花茎段外植体采用预处理洗衣粉溶液浸泡，流水冲洗。外植体消毒采用乙醇和升汞加吐温混合溶液进行消毒的方法，可以获得大量无菌试管苗，无菌外植体试管苗是进行初代培养的必须材料，并且污染率小、死亡率低，存活率高。附图说明图1为本专利技术实施例2芫花茎段外植体初代培养从接种到茎段腋芽萌发生长情况。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明。植物材料：芫花母本植株选自江苏省句容市，江苏农林职业技术学院林木种质资源圃。芫花茎段外植体采自芫花实生2年生苗。试验地点：江苏农林职业技术学院园艺工程中心植物组培室。试验设备：超净工作台(上海咏星SW-CJ-2A)、培养架与控制系统(上海咏星PYJ-5-2)、全光谱节能灯(上海咏星ZPT-28)、立式压力蒸汽灭菌器(上海农卉YXQ-LS-100SII)、空调(格力)、电子天平(梅特勒托利多AL104、PL602-L)、玻璃培养瓶。实验药品：NAA(1-萘乙酸1-Naphthylaceticacid，C12H10O2≧98.0％，国药)、6-BA(6-苄基氨基嘌呤6-Benzylaminopurine，C12H11N5≧98.0％，国药)、ZT(玉米素trans-Zeatin，C10H13N5O≧98.0％，国药)、蒸馏水、无水乙醇(ethylalcoholabsolute，C2H6O)、氯化汞(Mercury(II)chlorideHgCl2)、吐温80、洗衣粉、琼脂(agar，(C12H18O9)n，上海贺瑟根化工科技)、蔗糖(D(+)-Sucrose，C12H22O11)、MS培养基(北京金博蓝河科技)实施例1初代组织培养基：MS+0.1mg·L-1NAA+1.0mg·L-1ZT，加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L，调整酸碱度至pH＝5.8。培养方法：(1)芫花外植体的选取：采集生长健壮，腋芽饱满，无病虫害的芫花当年生枝条，去除全部叶片，剪截成10cm带腋芽茎段作为外植体；(2)芫花外植体的处本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种芫花茎段外植体初代组织培养基，其特征在于，包括如下组分：MS+0.1mg·L

【技术特征摘要】
1.一种芫花茎段外植体初代组织培养基，其特征在于，包括如下组分：MS+0.1mg·L-1NAA+1.0-1.5mg·L-1ZT，加入蔗糖20-30g/L、琼脂6.5-7g/L，调整酸碱度至pH＝5.7-5.8。2.根据权利要求1所述的初代组织培养基，其特征在于，包括如下组分：MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT，加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L，调整酸碱度至pH＝5.8。3.根据权利要求1所述的初代组织培养基，其特征在于，所述初代组织培养基用于芫花茎段外植体的初代组织培养方法，包括如下步骤：(1)芫花外植体的选取：采集生长健壮，腋芽饱满，无病虫害的芫花当年生枝条，去除全部叶片，剪截成8～10cm带腋芽茎段作为外植体；(2)芫花外植体的处理：将外植体用洗衣粉溶液浸泡洗涤15～20分钟，接着用流水冲洗8～12小时，在无菌环境下将外植体剪成4-5cm茎段进行消毒处理；消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成1.5～2.5cm的长度，接入芫花茎段外植体初代组织...

【专利技术属性】
技术研发人员：张虎，许建民，潘静霞，宋微，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32