一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法技术

本发明专利技术提供一种植物叶片高效再生体系建立的方法，其主要步骤如下：1.盐生草无菌苗叶片分生组织的获得，以无菌培养15‑20d的盐生草叶片分生组织为外植体；2.愈伤组织的诱导培养；3.愈伤组织的继代培养；4.愈伤组织的分化及再生培养；5.丛生芽的生根培养获得再生植株。该方法能够快速高效地建立盐生草再生体系，操作简单，成本廉价，再生植株生长良好，以期为盐生草遗传改良研究奠定基础。

Method for establishing efficient regeneration system of salt leaf grass meristem

The invention provides a leaf regeneration system establishment method, its main steps are as follows: 1. halogeton aseptic seedling leaf meristem, with 15 20d sterile culture salt leaf meristem explants; induced 2. callus; 3. calli subculture and differentiation; 4. regeneration of callus culture; 5. bud rooting regenerated plants. The method can be used to establish the regeneration system of halophytes quickly and efficiently. The method is simple, cheap, and good for the growth of regenerated plants, so as to lay the foundation for genetic improvement of halophytes.

【技术实现步骤摘要】
一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法
本专利技术涉及一种植物叶片高效再生体系建立的方法，尤其是一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法。
技术介绍
一年生草本盐生植物盐生草（Halogetonglomeratus），隶属于藜科（Chenopodiaceae）盐生草属（Halogeton）。多生长于干旱、半干旱荒漠地带的盐渍地，具有适应盐碱、干旱和高温等逆境的特性，是我国西北旱区、中亚特有的抗旱耐盐植物，且防风固沙的功效显著，具有极为重要的生态价值。由于大多数传统作物耐盐性均较弱、耐盐种质多样性差的共性特征，故从盐生植物中发掘耐盐基因，通过遗传转化手段提高作物耐盐性是解决土壤盐渍化问题的主要策略。只有建立了稳定，高频的再生体系，才能构建较好的遗传转化体系，提高转化效率，获得转基因植株，进而对培育耐盐作物新品种具有重要意义。已有专利文献ZL201510113016.8和ZL201510112968.8分别报道了快速诱导盐生草胚性愈伤组织的方法和快速诱导繁殖盐生草幼根愈伤组织的方法，但仍不能解决盐生草再生体系建立的问题，本专利技术在上述2个专利技术的基础上进一步对盐生草再生体系进行优化，最终确定了盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术提供了一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法。本专利技术公开了一种以盐生草叶片分生组织为外植体材料，通过愈伤组织的诱导、继代、分化及再生，最终获得再生植株，以期为盐生草遗传改良研究奠定基础。一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤如下：（1）盐生草无菌叶片分生组织的获得：常规灭菌后的盐生草种子进行无菌培养15-20d，取其分生组织作为诱导愈伤的外植体；（2）愈伤组织的诱导：将步骤（1）获得的无菌外植体接种于诱导愈伤组织的培养基，培养15-20d，诱导愈伤组织的发生；（3）愈伤组织的继代培养：将步骤（2）获得的嫩绿色愈伤组织转接至继代培养基，培养15-20d，使其增殖；（4）愈伤组织的分化及再生培养：将步骤（3）获得的深绿色愈伤组织切割成直径0.3-0.5cm的小块，转接至分化培养基，培养20-25d，产生不定芽，然后将不定芽转接至相同的分化培养基连续培养1-2次，至生成丛生芽；（5）丛生芽的生根培养：将步骤（4）获得的丛生芽转接至生根培养基，培养25-30d，最终获得生长良好的再生植株。所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（1）所述的叶片分生组织为无菌苗第5，6片叶生成时的叶片分生组织。所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（2）所述的愈伤组织诱导培养基由MS基本培养基，2.0-2.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），0.5-1g/LPolyvinylpyrrolidone(PVP)，10-15mg/L谷氨酰胺，5-6g/L琼脂，20-30g/L蔗糖组成，PH=5.8-6.0。所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（3）所述的愈伤组织继代培养基由MS基本培养基，0.5-1mg/L2，4-D，0.5-1g/LPolyvinylpyrrolidone(PVP)，10-15mg/L谷氨酰胺，5-6g/L琼脂，20-30g/L蔗糖组成，PH=5.8-6.0。所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（4）所述的愈伤组织的分化及再生培养的培养基由MS基本培养基，0.5-1mg/L6-BA，1.5-2mg/LKT，0.15-0.25mg/LNAA，2-2.5g/L酪蛋白，0.5-1g/LPolyvinylpyrrolidone(PVP)，10-15mg/L谷氨酰胺，5-6g/L琼脂，20-30g/L蔗糖组成，PH=5.8-6.0。所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（5）所述丛生芽的生根培养基由MS基本培养基，4-5g/L琼脂，20-30g/L蔗糖组成，PH=5.8-6.0。所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，步骤（1）、（2）、（3）、（4）、（5）均在连续光照培养，光照强度在1500-2000lx之间，湿度60-70%的环境下进行。本专利技术的有益效果如下：（1）以盐生草无菌苗第5，6片叶生成时的叶片分生组织为诱导愈伤的外植体，且愈伤组织的诱导与继代培养基中加入2，4-D，Polyvinylpyrrolidone(PVP)以及谷氨酰胺，可有效地克服愈伤组织质量差，生长速度缓慢的缺点。（2）在愈伤组织分化培养过程中，以6-BA，KT，NAA为外源激素，并加入酪蛋白，Polyvinylpyrrolidone(PVP)以及谷氨酰胺，最终可获得大量形状一致，遗传稳定性高的盐生草丛生芽，满足试验需求。（3）整个培养过程在可控条件下进行，不受气候条件和盐生草自然生长周期的限制，杜绝了病虫害的干扰，实现了简单、易行、高效获得盐生草再生体系的目标。附图说明图1是叶片分生组织培养15-20d后的盐生草愈伤组织的照片；图2是继代培养15-20d后的盐生草愈伤组织的照片；图3是愈伤组织培养20-25d后分化出的不定芽的照片；图4是不定芽分化培养20-25d后产生的丛生芽的照片；图5是丛生芽转接至生根培养基25-30d获得的再生植株的照片。具体实施方式为使专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本专利技术的实施方式仅仅是示例性的，并且本专利技术并不限于这些实施方式。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本专利技术的技术方案，在附图中仅仅示出了与根据本专利技术的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。实施例1一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，将常规灭菌后的盐生草种子进行无菌培养16d，取其分生组织作为诱导愈伤的外植体，将其转接至诱导培养基，培养15d，然后将获得的愈伤组织转接至继代培养基19d后，选取深绿色愈伤组织切割成直径0.3cm的小块，置于分化培养基，培养21d，分化出不定芽，接着将不定芽转接至相同的分化培养基23d后生成丛生芽，最后将丛生芽置于生根培养基，培养28d。其中诱导培养基主要由MS基本培养基，2.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），0.5g/LPolyvinylpyrrolidone(PVP)，10mg/L谷氨酰胺，5g/L琼脂，30g/L蔗糖组成；继代培养基主要由MS基本培养基，1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），0.6g/LPolyvinylpyrrolidone(PVP)，12mg/L谷氨酰胺，5g/L琼脂，30g/L蔗糖组成；分化及再生培养基主要由MS基本培养基，0.5mg/L6-BA，2mg/LKT，0.25mg/LNAA，2g/L酪蛋白，0.6g/LPolyvinylpyrrolidone(PVP)，10mg/L谷氨酰胺，5g/L琼脂，30g/L蔗糖组成。愈伤诱导、继代、分化及生根培养均在25℃的环境下进行，且为连续光照培养，光照强度在1000lx之间，PH=5.8。结果表明：愈伤组织诱导率100%，芽分化率45%，且能得到大量深绿色丛生芽，其生根率100%，整个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，其特征在于步骤为：（1）盐生草无菌叶片分生组织的获得：常规灭菌后的盐生草种子进行无菌培养15‑20d，取其分生组织作为诱导愈伤的外植体；（2）愈伤组织的诱导：将步骤（1）获得的无菌外植体接种于诱导愈伤组织的培养基，培养15‑20d，诱导愈伤组织的发生；（3）愈伤组织的继代培养：将步骤（2）获得的嫩绿色愈伤组织转接至继代培养基，培养15‑20d，使其增殖；（4）愈伤组织的分化及再生培养：将步骤（3）获得的深绿色愈伤组织切割成直径0.3‑0.5cm的小块，转接至分化培养基，培养20‑25d，产生不定芽，然后将不定芽转接至相同的分化培养基连续培养1‑2次，至生成丛生芽；（5）丛生芽的生根培养：将步骤（4）获得的丛生芽转接至生根培养基，培养25‑30d，最终获得生长良好的再生植株。

【技术特征摘要】
1.一种盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，其特征在于步骤为：（1）盐生草无菌叶片分生组织的获得：常规灭菌后的盐生草种子进行无菌培养15-20d，取其分生组织作为诱导愈伤的外植体；（2）愈伤组织的诱导：将步骤（1）获得的无菌外植体接种于诱导愈伤组织的培养基，培养15-20d，诱导愈伤组织的发生；（3）愈伤组织的继代培养：将步骤（2）获得的嫩绿色愈伤组织转接至继代培养基，培养15-20d，使其增殖；（4）愈伤组织的分化及再生培养：将步骤（3）获得的深绿色愈伤组织切割成直径0.3-0.5cm的小块，转接至分化培养基，培养20-25d，产生不定芽，然后将不定芽转接至相同的分化培养基连续培养1-2次，至生成丛生芽；（5）丛生芽的生根培养：将步骤（4）获得的丛生芽转接至生根培养基，培养25-30d，最终获得生长良好的再生植株。2.如权利要求1所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，其特征在于步骤（1）所述的叶片分生组织为无菌苗第5和6片叶生成时的叶片分生组织。3.如权利要求1所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，其特征在于步骤（2）所述的愈伤组织诱导培养基由MS基本培养基，2.0-2.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D），0.5-1g/LPolyvinylpyrrolidone(PVP)，10-15mg/L谷氨酰胺，5-6g/L琼脂，20-30g/L蔗糖组成，PH=5.8-6.0。4.如权利要求1所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，其特征在于步骤（3）所述的愈伤组织继代培养基由MS基本培养基，0.5-1mg/L2，4-D，0.5-1g/LPolyvinylpyrrolidone(PVP)，10-15mg/L谷氨酰胺，5-6g/L琼脂，20-30g/L蔗糖组成，PH=5.8-6.0。5.如权利要求1所述的盐生草叶片分生组织高效再生体系建立的方法，其特征在于步骤（4）所述的愈伤组织的分化及再生培养的培养基由MS基本培养基，0.5-1mg/L6-BA，1.5-2mg/LKT，0.15-0...

【专利技术属性】
技术研发人员：王化俊，姚立蓉，汪军成，任盼荣，孟亚雄，李葆春，马小乐，杨轲，赖勇，司二静，闫栋，周振国，张燕，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62