本发明专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种调控芍药花色苷积累的miR156e‑3p及其植物表达载体和构建方法。所述的调控芍药花色苷积累的miR156e‑3p，其成熟体序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列为SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了含有芍药miR156e‑3p前体序列的植物表达载体，是由芍药miR156e‑3p前体序列与中间植物表达载体构成。本发明专利技术提供的芍药miR156e‑3p是一个新的调控花色苷积累的miRNA，其可提高植物的花色苷含量、改变色泽。构建的芍药miR156e‑3p植物表达载体，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，提高花色苷积累、创制色泽改变的新种质。
MiR156e 3P herbaceous peony anthocyanin accumulation and plant expression vector and construction method
The invention belongs to the field of biological engineering, in particular to a regulation of peony anthocyanin accumulation miR156e 3P and its plant expression vector and construction method. The herbaceous peony anthocyanin accumulation of miR156e 3P, the mature sequence such as SEQ ID in NO.1 precursor sequence of SEQ ID NO.2 shown. The invention also discloses a miR156e contain peony 3P precursor sequence of plant expression vector by miR156e peony 3P precursor sequence and intermediate plant expression vector composition. The invention provides peony miR156e 3P is a new regulation of anthocyanin accumulation of miRNA, which can improve the content of anthocyanins, the changes of plant color. The peony miR156e plant expression vector 3P can be used for Agrobacterium mediated genetic transformation, new germplasm to improve anthocyanin accumulation and development of color change.
【技术实现步骤摘要】
调控芍药花色苷积累的miR156e-3p及其植物表达载体和构建方法
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种调控芍药花色苷积累的miR156e-3p及其植物表达载体和构建方法。
技术介绍
色泽对于观赏植物而言至关重要，它不仅影响植株的外观品质，而且直接关系到其商品价值。植物色泽是由多种因素共同作用形成的，其中色素的种类及其含量最为重要，主要包括叶绿素、类黄酮、类胡萝卜素和生物碱等四大类物质。在这些物质中，类黄酮是最重要的色素类群，产生的颜色范围最广，可以从浅黄色到蓝紫色，是众多观赏植物呈色的主要色素。而作为类黄酮色素群的主要种类，花色苷在红色的形成中起着不可替代的作用。芍药作为我国的传统名花，因其花大色艳、花型多变而广受人民的喜爱，已成为近年来市场上流行的高档切花，广泛用于婚礼、宴会等喜庆场合。芍药花色丰富，分别有白、粉、红、紫、墨、蓝、黄、绿、复色等色泽，但芍药品种大多分布于粉、红色系及其衍生色，而这些色泽主要是由花色苷所决定。迄今为止，关于芍药中花色苷积累的研究主要集中在转录水平上，已经明确了芍药花色苷的生物合成途径及其关键基因，PAL、CHS、DFR和ANS等基因均对芍药中花色苷积累起着重要调控作用，通过转这些基因能够在一定程度上改变色泽。而在转录后水平上，目前还未见到关于调控花色苷积累的相关报道。miRNA是生物体内长度为21～22个核苷酸的非蛋白编码小RNA，其主要和转录因子通过相互协作来调节下游目标基因的表达，在调节基因表达转录后水平中起着重要的作用。目前，关于miRNA在植物上的功能主要集中于植物生长发育、生殖分化和抵抗逆境胁迫，而在花色苷调控方面，miRNA主要是通过负调控与花青素合成有关的转录因子等的转录或翻译，抑制靶基因的表达，进而调控植物色泽。例如：Yang等将miR828进行转基因研究后发现miR828能够抑制植株体内花色苷的合成，野生拟南芥植株中花色苷含量比miR828转基因植物高2.5倍；Tang等通过STTM技术沉默了拟南芥叶片内源的miR165/166，发现与花色苷生物合成有关的一些基因大量表达，从而引起植株体内的花色苷含量显著增加，色泽发生改变；Wang等发现在缺磷条件下，miR778能促进花色苷的积累，转miR778拟南芥植株中积累的花色苷含量比野生型植株高1.9倍，相反地，构建使miR778沉默表达的MIM778转基因拟南芥植株积累的花色苷含量与野生型植株并无差别，这也证明了在磷不足的条件下，过量表达的miR778能够促进花青素的积累。此外，miR156调控花色苷积累的能够在拟南芥上也进行了较为深入的研究。而与芍药花色苷合成相关的miRNA序列尚不清楚。在植物的遗传转化途径中，农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。将调控芍药花色苷积累的miRNA构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，能够创制色泽改变的新种质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于填补芍药上调控花色苷积累的miRNA序列的空白，提供一个新的芍药miR156e-3p序列。本专利技术还提供该miR156e-3p的植物表达载体及其构建方法和应用。所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高花色苷积累、创制色泽改变的新种质。本专利技术采用的技术方案：调控芍药花色苷积累的miR156e-3p，其成熟体序列为：5′-GCTCTCTCTTCGTCTGTCATC-3′(SEQIDNO.1)，前体序列为：5′-ACGAAGAAGAGAAAGAAATGTTGACAGAAGAGAGGGAGCACAACCCGGGATCAGCTAAAGGGT-3′(SEQIDNO.2)。调控芍药花色苷积累的miR156e-3p植物表达载体，由本专利技术所述的芍药miR156e-3p前体序列与中间植物表达载体pCAMBIA1301构成。调控芍药花色苷积累的miR156e-3p植物表达载体，其构建方法：是将序列如SEQIDNO.2所示芍药miR156e-3p前体序列与中间植物表达载体连接形成。具体步骤如下：(1)调控芍药花色苷积累的miR156e-3p前体序列克隆：以芍药‘金辉’红色外瓣为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物扩增miR156e-3p前体序列，上游引物miR156e-3p-F:5′-ACGAAGAAGAGAAAGAAATGTTGAC-3′(SEQIDNO.3)，下游引物miR156e-3p-R:5′-ACCCTTTAGCTGATCCCGGGTTGTG-3′(SEQIDNO.4)，以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，产物连接到pEASYTM-T5ZeroCloningVector载体，转化Trans-T1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆进行序列测定；(2)植物表达载体pCAMBIA1301-miR156e-3p的构建：设计引物以芍药‘金辉’红色外瓣cDNA为模板，进行PCR扩增，在miR156e-3p前体序列的上游和下游分别引入BamHI和KpnI酶切位点，上游引物miR156e-3p-TF:5′-CGCGGATCCACGAAGAAGAGAAAGAAATGTTGAC-3′(SEQIDNO.5)，下游引物miR156e-3p-TR:5′-CGGGGTACCACCCTTTAGCTGATCCCGGGTTGTG-3′(SEQIDNO.6)。PCR产物连接到pEASYTM-T5ZeroCloningVector载体，转化Trans-T1感受态细胞，而后在附加0.1％氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆、提取阳性质粒，BamHI和KpnI双酶切的miR156e-3p前体序列片段与BamHI和KpnI双酶切的pCAMBIA1301连接、转化，提取阳性质粒，酶切电泳检测并测序验证，植物表达载体pCAMBIA1301-miR156e-3p构建成功。(3)芍药miR156e-3p的植物表达载体用于农杆菌介导的植物遗传转化，提高花色苷积累、创制色泽改变的新种质，方法如下：农杆菌菌株EHA105感受态制备及冻融法转化；拟南芥花序浸染及种子筛选；转基因植株鉴定及色泽与花色苷含量评价。本专利技术的有益效果体现在：1、本专利技术提供的芍药miR156e-3p是一个新的调控花色苷积累的miRNA，其可提高植物的花色苷含量、改变色泽。2、本专利技术构建的芍药miR156e-3p植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，提高花色苷积累、创制色泽改变的新种质。附图说明图1前体序列的琼脂糖凝胶电泳检测。M：50bpDNALadderMarker；1：miR156e-3p前体序列扩增产物；图2质粒酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测。M：20bpDNALadderMarker；1：pCAMBIA1301-miR156e-3p质粒双酶切产物。图3植物表达载体pCAMBIA1301-miR156e-3p图谱。图4拟南芥侧枝GUS区扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测。图5拟南芥抽薹初期植株及侧枝表型。A：拟南芥植株；B：茎秆及侧枝；C：侧枝；箭头所指之处为侧枝。具体实施方式所涉及的pCAMBIA1301为商品化植物载体。实施例1.miR156e-3p前体序列的克隆选用芍药‘金辉’红色外瓣作为材料，参照M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种调控芍药花色苷积累的miR156e‑3p，其成熟体序列如SEQ ID NO.1所示，前体序列为SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种调控芍药花色苷积累的miR156e-3p，其成熟体序列如SEQIDNO.1所示，前体序列为SEQIDNO.2所示。2.一种含有芍药miR156e-3p前体序列的植物表达载体，所述芍药miR156e-3p前体序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求2所述的植物表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵大球，陶俊，魏梦苒，夏星，孙静，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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