全血中阿比特龙的定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种全血中阿比特龙的定量检测方法，以全血作为待测对象，依次进行以下步骤：在全血裂解液中加入乙酸乙酯振荡漩涡后离心，乙酸乙酯层氮气流吹干后用20％乙腈水溶液复溶后离心，吸取上清液Ⅰ；称取碱性硅藻土放入玻璃层析柱中，振动处理，然后加入上清液Ⅰ依次用纯水、20％甲醇水溶液、色谱甲醇洗脱，洗脱液氮气流吹干后用20％乙腈水溶液复溶后离心，吸取上清液Ⅱ进行高效液相色谱系统分析，得阿比特龙药物峰面积Y，代入公式Y＝27524X+1956.6，X为上清液Ⅱ的阿比特龙浓度；然后经换算，得待测全血中的阿比特龙浓度。

The quantitative detection method in whole blood of abiraterone

The invention discloses a quantitative detection method of abiraterone in whole blood, with blood as the object to be measured, followed by the following steps: adding ethyl acetate after centrifugal vortex oscillation in whole blood lysates, ethyl acetate layer dry nitrogen stream with 20% acetonitrile water solution after re dissolution from the heart, supernatant was weighed 1; alkaline diatomite put into a glass column, then add the supernatant of vibration treatment, followed by pure water, 20% aqueous methanol, methanol elution chromatography, eluting liquid nitrogen and airflow drying by 20% acetonitrile aqueous solution after rehydration after centrifugation, supernatant was analyzed by HPLC system II, to abiraterone drug peak area of Y, into the formula Y = 27524X+1956.6, X for abiraterone concentration of supernatant; and then through the conversion, to abiraterone concentration in whole blood sample.

【技术实现步骤摘要】
全血中阿比特龙的定量检测方法
本专利技术涉及一种动物(包括人)全血中阿比特龙的定量检测方法。
技术介绍
前列腺癌是欧美男性常见的一种恶性肿瘤，每年新增诊断人数约为240000，是肿瘤男性死亡率第2的肿瘤，且转移性强。据统计，2012年大约28000人死于该病。虽然我国前列腺癌发病率远低于西方国家，但是随着生活方式的改变，前列腺癌特异抗原筛查的普及，我国前列腺癌的患病人数也呈直线型上升趋势，且其中大多数发展为晚期前列腺癌。其发展的主要机制为细胞内雄性激素受体受到雄性激素的持续刺激，目前对于前列腺癌的首选治疗方法为去势治疗，但研究显示初期显效后平均36个月后很大一部分患者发展为去势抵抗性前列腺癌，经过研究后发现患者在接受治疗后前列腺癌细胞内仍可继续合成少量雄性激素。随后的研究发现，第一代雄激素受体拮抗剂酮康唑可调控雄性激素轴，但是治疗效果短暂，并且酮康唑对于抑制雄性激素合成的耐受性很差。多项研究表明，在血清睾酮达到去势水平，前列腺癌细胞内的雄性激素受体信号轴依然能够保持活性，并对其增殖具有重要影响作用。临床研究证实，去势治疗后血清前列腺癌特异抗原的增加可被二线激素治疗药物所降低，且雄激素受体通路活性与睾酮循环水平无关。阿比特龙是一种抗雄激素药物，为雄激素代谢过程中的CYP17酶抑制剂，属于内分泌治疗范畴，该药物通过阻断雄激素生物合成的关键酶降低睾酮水平，除了睾丸、肾上腺来源的睾酮外，还可以降低前列腺肿瘤内部微环境中的雄激素合成。阿比特龙可以强烈抑制17α-羟化酶/C17，2-裂解酶(CYP17)，从而显著抑制雄激素的生物合成，在小鼠的药物代谢动力学模型中阿比特龙对于CYP17的抑制活性远远超过酮康唑。I期临床试验结果表明，阿比特龙在去势环境下不仅可以很好地抑制睾酮水平，而且具有很好的耐受性，也没有表现出像酮康唑一样的毒性反应。开放、单中心和剂量递增的临床试验表明持续阿比特龙治疗可以使50％～57％的患者血清中前列腺癌特异抗原降低，且II期临床推荐治疗剂量为1000mg/d，在此剂量下可同时抑制糖皮质激素和雄激素的合成。阿比特龙化学结构式如式1所示。目前，关于阿比特龙的定量检测与分析，尚未见国内相关文献报道。西南交通大学制药工程学院吴青松等开展了乙酸阿比特龙酯的合成及其质量检测研究，其采用LunaC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长220nm，柱温40℃，流动相A相为甲醇-乙腈(80％-20％)、流动相B相为水，梯度洗脱(洗脱程序见表1)，定量分析了乙酸阿比特龙酯和作为杂质存在的阿比特龙的含量。检测结果显示，阿比特龙与其他杂质分离较好，峰形也非常对称，无前展或拖尾现象。但是该研究是在合成反应提取物中进行的检测，而且样品已经进行了前期净化处理，在反应样品中无蛋白、脂质成分等细胞内生物杂质干扰。表1.梯度洗脱程序国外期刊报道了印度Kumar等采用RP-HPLC方法定量分析了大鼠血浆中阿比特龙。该文献显示采用BetasilC18色谱柱，利用乙酸乙酯萃取，室温环境下定量检测了大鼠血浆中阿比特龙含量。其回收率为70％以上，流动相为乙腈-水-0.01M磷酸二氢钾(pH3.0)＝55-5-40(V/V/V)。根据文献可知，动物血浆中阿比特龙HPLC检测能够定量分析生物样品中阿比特龙含量，结果定量准确、灵敏、重复性好，日内和日间变异系数较小，能够满足动物体内阿比特龙药物代谢动力学研究。然而该研究只是定量分析了动物血浆中阿比特龙含量，动物血浆为去除红细胞、白细胞、淋巴细胞等细胞成分的一类生物样品，细胞内大量的生物杂质已经被清除，从而使得血浆样品相比已经比较干净。因此，目前的研究只是定量检测了血浆或血清中阿比特龙含量，尚未得知血液中所含的各类血细胞(包括红细胞、白细胞等)中阿比特龙含量，也难以求出全血中阿比特龙含量。血细胞作为药物的一个重要储库和缓冲器，有时候需要全面评价药物在血细胞中的分布特征，从而在联合用药方面保证协同活性，降低联合用药的副作用。因此，获知全血中阿比特龙含量有其特定作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种全血(包括血浆和血细胞)中阿比特龙含量的准确、定量检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种全血中阿比特龙的定量检测方法，以全血作为待测对象，依次进行以下步骤：1)、吸取全血裂解液0.4mL于带盖容器(带盖离心管)中，加入乙酸乙酯3mL，振荡器漩涡2±0.2min，8000±500r/min高速离心5±0.5min，分别得位于上层的乙酸乙酯层、位于下层的残渣；在残渣中加入2mL乙酸乙酯重复上述振荡器漩涡、高速离心(振荡器漩涡2±0.2min，8000±500r/min高速离心5±0.5min)；即，残渣再重复萃取一次；合并两次离心所得的乙酸乙酯层；于45±1℃水浴中氮气流吹干，所得的干燥物用0.2mL的20％(体积％)乙腈水溶液复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅰ；备注说明：此上清液Ⅰ的体积为0.2mL；即，高速离心产生的沉淀微乎其微，可忽略不计；2)、称取碱性硅藻土(pH为8.5的硅藻土)4g放入玻璃层析柱(10×200mm规格)中，振动(于100Hz振动泵)处理5±0.5min；3)、然后将步骤1)中的上清液Ⅰ(0.2mL)全部加入步骤2)的玻璃层析柱中，先用5mL纯水洗脱，然后用20％甲醇(v/v)水溶液5mL洗脱；最后用5mL色谱甲醇洗脱，收集色谱甲醇所对应的全部洗脱液，于45±1℃水浴中氮气流吹干，干燥物用0.2mL的20％乙腈水溶液复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅱ进行后续的高效液相色谱系统分析；备注说明：此上清液Ⅱ的体积为0.2mL；即，高速离心产生的沉淀微乎其微，可忽略不计；下述步骤的进样量20μL，即，相当于取了1/10体积的上清液Ⅱ进行后续步骤；4)、日本岛津shimadzu20AT高效液相色谱系统，浙江大学智达N2000色谱工作站，色谱柱采用ThermoHypersilBDSC18色谱柱(3μm,250mm×4.6mm)；流动相为乙腈-水-0.01M磷酸二氢钠(pH2.5)＝60:5:35(v/v)，流速1.0mL/min，柱温40℃，紫外检测波长254nm，进样量20μL；5)、以步骤4)所得的阿比特龙药物峰面积为Y，代入公式Y＝27524X+1956.6(r2＝0.9999)中，从而获得步骤3)所得的上清液Ⅱ中的阿比特龙浓度X，该X的单位为μg/ml；然后经换算，得待测全血中的阿比特龙浓度。作为本专利技术的全血中阿比特龙的定量检测方法的改进：所述步骤1)中的全血裂解液的制备方法为：在全血中加入等体积的细胞裂解液均匀震荡(于100±10r/min震荡5±0.5分钟)，得全血裂解液；所述细胞裂解液的配方为：氯化铵8.29g、碳酸氢钾1g和EDTA-2Na37.2mg，溶于1000mL超纯水中。换算公式为X*20μL*10÷0.2mL＝X；因此，待测全血中的阿比特龙浓度为X。为了验证本专利技术的方法的准确性和实用性，专利技术人进行了如下的试验：1、标准曲线制备准确称取阿比特龙标准品溶解于色谱甲醇中，作为储本文档来自技高网...

【技术保护点】
全血中阿比特龙的定量检测方法，其特征是：以全血作为待测对象，依次进行以下步骤：1)、吸取全血裂解液0.4mL于带盖容器中，加入乙酸乙酯3mL，振荡器漩涡2±0.2min，8000±500r/min高速离心5±0.5min，分别得位于上层的乙酸乙酯层、位于下层的残渣；在残渣中加入2mL乙酸乙酯重复上述振荡器漩涡、高速离心；合并两次离心所得的乙酸乙酯层；于45±1℃水浴中氮气流吹干，所得的干燥物用0.2mL的20％乙腈水溶液复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅰ；2)、称取碱性硅藻土4g放入玻璃层析柱中，振动处理5±0.5min；3)、然后将步骤1)中的上清液Ⅰ全部加入步骤2)的玻璃层析柱中，先用5mL纯水洗脱，然后用20％甲醇水溶液5mL洗脱；最后用5mL色谱甲醇洗脱，收集色谱甲醇所对应的全部洗脱液，于45±1℃水浴中氮气流吹干，干燥物用0.2mL的20％乙腈水溶液复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅱ进行后续的高效液相色谱系统分析；4)、色谱柱采用Thermo Hypersil BDS C18色谱柱(3μm,250mm×4.6mm)；流动相为乙腈‑水‑0.01M磷酸二氢钠＝60:5:35(v/v)，流速1.0mL/min，柱温40℃，紫外检测波长254nm，进样量20μL；5)、以步骤4)所得的阿比特龙药物峰面积为Y，代入公式Y＝27524X+1956.6中，从而获得步骤3)所得的上清液Ⅱ中的阿比特龙浓度X，该X的单位为μg/ml；然后经换算，得待测全血中的阿比特龙浓度。...

【技术特征摘要】
1.全血中阿比特龙的定量检测方法，其特征是：以全血作为待测对象，依次进行以下步骤：1)、吸取全血裂解液0.4mL于带盖容器中，加入乙酸乙酯3mL，振荡器漩涡2±0.2min，8000±500r/min高速离心5±0.5min，分别得位于上层的乙酸乙酯层、位于下层的残渣；在残渣中加入2mL乙酸乙酯重复上述振荡器漩涡、高速离心；合并两次离心所得的乙酸乙酯层；于45±1℃水浴中氮气流吹干，所得的干燥物用0.2mL的20％乙腈水溶液复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅰ；2)、称取碱性硅藻土4g放入玻璃层析柱中，振动处理5±0.5min；3)、然后将步骤1)中的上清液Ⅰ全部加入步骤2)的玻璃层析柱中，先用5mL纯水洗脱，然后用20％甲醇水溶液5mL洗脱；最后用5mL色谱甲醇洗脱，收集色谱甲醇所对应的全部洗脱液，于45±1℃水浴中氮气流吹干，干燥物用0.2mL的20％乙腈水溶液复溶，漩涡混匀1±0.2min，18000±500r/min高速离心5±0.5min后，吸取上清液Ⅱ进行后续的高效液相色谱系统分析；4)、色谱柱采...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓同乐，葛建，林芳，黄丽红，周益峰，胡华军，张永勇，刘冠男，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33