一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法。通过以下步骤完成：原料混合、微球成形及包覆、低温固化、洗脱过滤、低温干燥、颗粒成型。本发明专利技术以木聚糖酶的酶活回收率为标准，研究了海藻酸钠浓度、壳聚糖浓度、氯化钙浓度及固化时间等不同因素对酶活回收率的影响。该方法最终得到的固定化酶稳定性和酶活回收率较高，同时具有反应条件温和、酶活力损失小等优点，在饲料等工业应用中具有重要意义。

Method for fixing xylanase with sodium alginate chitosan

The invention relates to a method for fixing xylanase with sodium alginate chitosan. Completed by the following steps: raw material mixing, microsphere forming and coating, low temperature curing, elution filtration, low temperature drying, particle molding. The present invention takes xylanase recovery rate as the standard, and studies the influence of different factors such as sodium alginate concentration, chitosan concentration, calcium chloride concentration and curing time on enzyme activity recovery rate. The stability and enzyme recovery rate of the immobilized enzyme obtained by this method are higher, and the reaction conditions are mild and the enzyme activity loss is small. It is of great significance in industrial applications such as feed.

【技术实现步骤摘要】
一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法
本专利技术涉及一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法
技术介绍
木聚糖酶在饲料工业中应用广泛。小麦、玉米等基础饲料中含有大量的木聚糖，木聚糖具有较强的持水性、小分子吸附活性和表面活性，造成基础饲料对单胃或无胃动物具有强烈的抗营养作用。而木聚糖酶作为饲料添加剂使用，可有效消除木聚糖的抗营养作用。饲料中添加木聚糖酶可以降解植物细胞壁结构，降低畜禽肠道内容物黏度，提高内源性消化酶活性，减少肠道有害微生物数量，从而改善动物对养分的消化吸收以及饲料转化率，最终提高生长性能。但游离态的木聚糖酶在实际应用中也存在一些问题如稳定性差、易失活等，导致利用率较低，成本较高。因此，可根据酶的固定化原理，利用生物技术以期解决上述问题。酶的固定化是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内仍能进行其特有的催化反应并可回收重复使用的技术。与游离酶相比,固定化酶不但可保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性并且其贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点,不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域得到迅速发展而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。近年来国内外关于固定化木聚糖酶的载体选择逐渐转向于性能优越的天然高分子材料和有机合成材料。其中天然高分子材料具有无毒,成本低廉,传质性能好等特点,主要有海藻酸钠、壳聚糖等。目前如何改进木聚糖酶的稳定性,提高酶的活性回收率,找到应用于不同领域的固定化载体及合适的和新的方法对木聚糖酶进行固定化,是今后研究发展的方向和趋势。而海藻酸钠，壳聚糖是最为常见的天然高分子材料，因此，本方法选用海藻酸钠为载体，通过与钙离子和壳聚糖作用表面形成不溶于水的致密膜，以改进木聚糖酶的稳定性，同时优化最佳条件，以提高酶活回收率。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法，以解决游离木聚糖酶在实际应用中存在的稳定性差、易失活变性、利用率低等问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法，通过以下步骤完成：(1)原料混合步骤称取一定量的海藻酸钠充分溶解于蒸馏水中形成一胶体溶液，向该胶体溶液中加入适量的木聚糖酶液，调节pH至6.0～7.0，充分搅拌混匀，得到混合液1；分别称取一定量的壳聚糖和氯化钙溶解于蒸馏水中，调节pH至3.0～6.0，充分搅拌混匀，得到混合液2；(2)微球成形及包覆步骤采用带有针头的蠕动泵将步骤(1)所得混合液1，滴入至步骤(1)所得混合液2中，得到直径2～3mm的光滑微球；(3)低温固化步骤将步骤(2)中所得光滑微球置于3℃-10℃环境中进行低温固化得到固化微球，其中低温固化时间为1～4h；(4)洗脱过滤步骤将步骤(3)制备的固化微球以蒸馏水冲洗去除表面残留杂质得到洗脱微球；(5)低温干燥步骤将洗脱微球置于35～45℃的恒温干燥箱内进行低温干燥得到近似球型颗粒，干燥时间4～8h；(6)颗粒成型筛选步骤(5)得到的近似球型的固定化酶颗粒。在本专利技术的一个优选实施例中，所述步骤(1)中，所述海藻酸钠质量百分比浓度为1.0～3.0％，所述壳聚糖质量百分比浓度为0.5～4.5％,氯化钙质量百分比浓度为0.5～2.5％。在本专利技术的一个优选实施例中，所述步骤(1)中，所述混合液1制备过程中的pH值采用质量百分比浓度为5％的醋酸溶液进行调节。在本专利技术的一个优选实施例中，所述步骤(1)中，所述混合液2制备过程中的pH值采用质量百分比浓度为5％的醋酸溶液进行调节。在本专利技术的一个优选实施例中，所述步骤(2)中，所述混合液1以3滴/秒的速度滴入至步骤(1)所得混合液2中。在本专利技术的一个优选实施例中，所述步骤(3)重复三次。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤(6)得到的近似球型颗粒的固定化木聚糖酶进行包埋率、稳定性及酶活回收率测定方法如下：固定化酶的包埋率测定：固定化酶的包埋率(％)＝固定化酶量(g)/酶总添加量(g)×100％；固定化酶活回收率测定：酶活回收率(％)＝固定化酶的总活力/游离酶的总活力×100％固定化酶的稳定性测定：分别取一定量的固定化酶与游离酶；(a)在18℃、28℃、38℃、48℃、58℃、68℃、78℃温度下分别测定固定化酶与游离酶的活力；(b)在pH值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0值下测定固定化酶与游离酶的活力。本专利技术的有益效果本专利技术的一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法，根据固定化酶的包埋原理，以天然高分子材料海藻酸钠及壳聚糖为载体，具有反应条件温和、保护酶分子结构、酶活力损失小等优点；该方法最终得到的固定化酶稳定性和酶活回收率较高，在饲料等工业应用中具有重要意义。附图说明图1本专利技术实施例1不同温度下游离酶与固定化酶的相对酶活比较曲线图。图2本专利技术实施例1不同pH值条件下游离酶与固定化酶的相对酶活比较曲线图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明，但并不限制本专利技术。实施例1一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法，具体步骤如下：(1)原料混合称取4.0g的海藻酸钠充分溶解于蒸馏水中，向该胶体溶液中加入适量的木聚糖酶液，调节pH至6.0～7.0(pH值由5％醋酸溶液调至，下同)，充分搅拌混匀，得到混合液1a，其中海藻酸钠质量百分比浓度为2.0％。分别称取3.0g壳聚糖和4.0g氯化钙溶解于蒸馏水中，调节pH至5.5，充分搅拌混匀，得到混合液2a，其中壳聚糖质量百分比浓度为1.5％,氯化钙质量百分比浓度为2.0％。(2)微球成形及包覆采用带有针头的蠕动泵将(1)所得混合液1a，以3滴/秒的速度滴入至步骤(1)所得混合液2a中，得到直径2～3mm的光滑微球。(3)低温固化将步骤(2)中所得光滑微球置于4℃环境中进行低温固化，固化时间为1h。(4)洗脱过滤将步骤(3)固化后的微球以蒸馏水冲洗去除表面残留杂质，重复3次。(5)低温干燥将洗脱后的微球置于40℃的恒温干燥箱内，干燥时间6h。(6)颗粒成型筛选收集干燥后的近似球型的固定化酶颗粒。在该工艺条件下得到的固定化酶颗粒的包埋率为92％，酶活回收率为64.7％固定化酶的稳定性测定；(a)结果如附图1所示的不同温度下游离酶与固定化酶的相对酶活比较，游离酶的最适温度范围为37～39℃，固定化酶的最适温度范围为47～48℃，由于海藻酸钠-壳聚糖壁材的保护作用，固定化酶的耐热稳定性有明显提高。(b)结果如附图2所示的不同pH值条件下游离酶与固定化酶的相对酶活比较，游离酶的最适pH范围为4.5～5.5，固定化酶的最适pH范围为5.5～6.5，固定化酶的最适pH范围有所提高，同时由于海藻酸钠-壳聚糖壁材在低pH(pH＝2.0～4.0)条件下有良好的稳定性，避免了木聚糖酶在胃液中的损失。实施例2一种海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法，具体步骤如下：(1)原料混合称取3.0g海藻酸钠充分溶解于蒸馏水中，向该胶体溶液中加入适量的木聚糖酶液，调节pH至6.0～7.0(pH值由5％醋酸溶液调至，下同)，充分搅拌混匀，得到混合液1b，其中海藻酸钠质量百分比浓度为1.5％。分别称取2.0g壳聚糖和5.0g氯化钙溶解于蒸馏水中，调节pH至5.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
海藻酸钠‑壳聚糖固定木聚糖酶的方法，其特征在于，通过以下步骤完成：(1)原料混合步骤称取一定量的海藻酸钠充分溶解于蒸馏水中形成一胶体溶液，向该胶体溶液中加入适量的木聚糖酶液，调节pH至6.0～7.0，充分搅拌混匀，得到混合液1；分别称取一定量的壳聚糖和氯化钙溶解于蒸馏水中，调节pH至3.0～6.0，充分搅拌混匀，得到混合液2；(2)微球成形及包覆步骤采用带有针头的蠕动泵将步骤(1)所得混合液1，滴入至步骤(1)所得混合液2中，得到直径2～3mm的光滑微球；(3)低温固化步骤将步骤(2)中所得光滑微球置于3℃‑10℃环境中进行低温固化得到固化微球，其中低温固化时间为1～4h；(4)洗脱过滤步骤将步骤(3)制备的固化微球以蒸馏水冲洗去除表面残留杂质得到洗脱微球；(5)低温干燥步骤将洗脱微球置于35～45℃的恒温干燥箱内进行低温干燥得到近似球型颗粒，干燥时间4～8h；(6)颗粒成型筛选步骤(5)得到的近似球型的固定化酶颗粒。

【技术特征摘要】
1.海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法，其特征在于，通过以下步骤完成：(1)原料混合步骤称取一定量的海藻酸钠充分溶解于蒸馏水中形成一胶体溶液，向该胶体溶液中加入适量的木聚糖酶液，调节pH至6.0～7.0，充分搅拌混匀，得到混合液1；分别称取一定量的壳聚糖和氯化钙溶解于蒸馏水中，调节pH至3.0～6.0，充分搅拌混匀，得到混合液2；(2)微球成形及包覆步骤采用带有针头的蠕动泵将步骤(1)所得混合液1，滴入至步骤(1)所得混合液2中，得到直径2～3mm的光滑微球；(3)低温固化步骤将步骤(2)中所得光滑微球置于3℃-10℃环境中进行低温固化得到固化微球，其中低温固化时间为1～4h；(4)洗脱过滤步骤将步骤(3)制备的固化微球以蒸馏水冲洗去除表面残留杂质得到洗脱微球；(5)低温干燥步骤将洗脱微球置于35～45℃的恒温干燥箱内进行低温干燥得到近似球型颗粒，干燥时间4～8h；(6)颗粒成型筛选步骤(5)得到的近似球型的固定化酶颗粒。2.如权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述海藻酸钠质量百分比浓度为1.0～3.0％，所述壳聚糖质量百分比浓度为0.5～4.5％,氯化钙质量百分比浓度为0.5～2.5％。3.如权利要求1或2所述的海藻酸钠-壳聚糖固定木聚糖酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡青和，米雁，李明明，冯涛，朱琳娜，程媛媛，
申请(专利权)人：上海欧耐施生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31