枯草杆菌酶变体制造技术

本发明专利技术涉及在液体洗涤剂中表现出改进的稳定性和或改进的洗涤性能的新颖蛋白酶变体。本发明专利技术的这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤洗涤剂组合物和餐具洗涤组合物，包括自动餐具洗涤组合物。本发明专利技术还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明专利技术变体的方法。

Subtilisin variant

The present invention relates to novel protease variants exhibiting improved stability and improved washing properties in liquid detergents. These variants of the present invention are suitable for use in, for example, cleaning or detergent compositions, such as laundry detergent compositions and tableware washing compositions, including an automatic dishwashing detergent composition. The present invention also relates to isolated DNA sequences, expression vectors, host cells, and methods for producing and using variants of the present invention.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】枯草杆菌酶变体序列表的引用本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及在液体洗涤剂组合物中表现出增加的稳定性和/或改进的洗涤性能的新颖枯草杆菌酶变体。本专利技术的这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤洗涤剂组合物和餐具洗涤组合物，包括自动餐具洗涤组合物。本专利技术还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本专利技术变体的方法。相关技术说明在洗涤剂工业中，在洗涤配制品中酶已经应用了数十年。用于此类配制品的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。已经用于衣物洗涤的野生型枯草杆菌酶是WO91/02792中披露的BLAP蛋白酶。越来越多的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体，和(诺维信公司(Novozymesa/s))、Purafect和(杰能科国际公司(GenencorInternational,Inc.))。另外，许多变体在本领域中已有描述，例如在WO2004/041979(诺维信公司)中描述了相对于亲本枯草杆菌酶在例如洗涤性能、热稳定性、洗涤期间的稳定性或催化活性上表现出改变的枯草杆菌酶变体。这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用。BLAP蛋白酶的变体并且适用于清洁或洗涤剂组合物已经在例如EP701605中披露。WO99/57155披露了洗涤剂酶，例如通过将纤维素结合结构域附着到酶而被修饰的蛋白酶。建议将洗涤剂酶如蛋白酶与包含纤维素的织物结合，这将增强洗涤性能。然而，多种因素使得进一步改进蛋白酶是有利的。特别是液体洗涤剂组合物仍然是许多洗涤剂蛋白酶的挑战，并且在储存过程中的活性丧失仍然是许多良好洗涤剂蛋白酶的问题。因此，尽管蛋白酶开发的深入研究仍然需要具有令人满意的洗涤性能和增加的稳定性的新的并且改进的蛋白酶。专利技术概述本专利技术涉及与亲本枯草杆菌酶相比在液体洗涤剂中具有改进的稳定性和/或改进的洗涤性能的变体枯草杆菌酶。本专利技术涉及与SEQIDNO:3具有至少90％序列一致性，优选与SEQIDNO:3具有至少95％序列一致性，优选至少96％序列一致性，优选至少97％序列一致性，优选至少98％序列一致性的枯草杆菌酶变体，其中该变体在位置101具有谷氨酸残基(E)，并且其中与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，该变体具有在液体洗涤剂组合物中的增加的稳定性。枯草杆菌酶进一步包括选自下组的取代，该组由以下各项组成：S156D，L262E，Q137H，S3T，R45E、D、Q，P55N，T58W、Y、L，Q59D、M、N、T，G61D、R，S87E，G97S，A98D、E、R，S106A、W，N117E，H120V、D、K、N，S124M，P129D，E136Q，S143W，S161T，S163A、G，Y171L，A172S，N185Q，V199M，Y209W，M222Q，N238H，V244T，N261T、D以及L262N、Q、D。定义等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这些调控序列包括但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。洗涤剂组合物：除非另外指明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒或粉末形式的通用或重垢型洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效洗涤剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手工洗碗剂或轻负荷洗碗剂，尤其是高起泡类型的那些；机器洗碗剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌性手洗型、清洁条、皂条、漱口液、义齿清洁剂、轿车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和洗发剂；沐浴凝胶、泡沫浴液；金属清洁剂；以及清洁助剂如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理型添加剂。就预期用于弄脏的物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代性实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具洗涤洗涤剂”)。它并不意图使本专利技术限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。其意图是，除了根据本专利技术的枯草杆菌酶变体以外，该术语涵盖了可能包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelatingagent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。餐具洗涤：术语“餐具洗涤”是指所有形式的洗涤餐具，例如手动或自动餐具洗涤。洗涤餐具包括但不限于，清洁所有形式的陶器，例如盘子、杯子、玻璃杯、碗，所有形式的用餐工具，例如匙、刀、叉，以及上菜用具连同陶瓷，塑料(例如三聚氰胺)，金属，瓷器，玻璃及丙烯酸酯。餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本专利技术不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。硬表面清洁：在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但本文档来自技高网...

【技术保护点】
与SEQ ID NO:3具有至少90％的序列一致性，优选与SEQ ID NO:3具有至少95％的序列一致性、优选至少96％的序列一致性、优选至少97％的序列一致性、优选至少98％的序列一致性的一种枯草杆菌酶变体，其中该变体在位置101处具有谷氨酸残基(E)，其中该枯草杆菌酶变体进一步包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：S156D，L262E，Q137H，S3T，R45E、D、Q，P55N，T58W、Y、L，Q59D、M、N、T，G61D、R，S87E，G97S，A98D、E、R，S106A、W，N117E，H120V、D、K、N，S124M，P129D，E136Q，S143W，S161T，S163A、G，Y171L，A172S，N185Q，V199M，Y209W，M222Q，N238H，V244T，N261T、D和L262N、Q、D，其中与具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，该变体具有在液体洗涤剂组合物中的增加的稳定性，并且其中这些位置对应于SEQ ID NO:1的位置。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.15 EP 14197968.2;2014.12.15 EP 14197966.61.与SEQIDNO:3具有至少90％的序列一致性，优选与SEQIDNO:3具有至少95％的序列一致性、优选至少96％的序列一致性、优选至少97％的序列一致性、优选至少98％的序列一致性的一种枯草杆菌酶变体，其中该变体在位置101处具有谷氨酸残基(E)，其中该枯草杆菌酶变体进一步包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：S156D，L262E，Q137H，S3T，R45E、D、Q，P55N，T58W、Y、L，Q59D、M、N、T，G61D、R，S87E，G97S，A98D、E、R，S106A、W，N117E，H120V、D、K、N，S124M，P129D，E136Q，S143W，S161T，S163A、G，Y171L，A172S，N185Q，V199M，Y209W，M222Q，N238H，V244T，N261T、D和L262N、Q、D，其中与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列的枯草杆菌酶相比，该变体具有在液体洗涤剂组合物中的增加的稳定性，并且其中这些位置对应于SEQIDNO:1的位置。2.如权利要求1所述的枯草杆菌酶变体，其中与具有SEQIDNO:3的枯草杆菌酶相比，该枯草杆菌酶进一步具有改进的洗涤性能。3.如权利要求1所述的枯草杆菌酶变体，其中与具有SEQIDNO:3的枯草杆菌酶相比，该枯草杆菌酶进一步具有改进的稳定性。4.如权利要求1至3中任一项所述的枯草杆菌酶变体，其中该枯草杆菌酶变体包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：R45E、D、Q；T58L；G61D；S87E；G97S；A98E；S160A；N117E；H120D、K、V；P129D；E136Q；Q137H；S156D；S161T；S163A、G；V199M；M222Q；N261T和L262E、QN。5.如权利要求1至4中任一项所述的枯草杆菌酶变体，其中该变体选自下组，该组由以下各项组成：SEQIDNO:3+S3T，SEQIDNO:3+R45E、DSEQIDNO:3+P55N，SEQIDNO:3+T58W、Y、L，SEQIDNO:3+Q59D、M、N、T，SEQIDNO:3+G61D、R，SEQIDNO:3+S87E，SEQIDNO:3+G97S，SEQIDNO:3+A98D、E、R，SEQIDNO:3+S106A、W，SEQIDNO:3+N117E，SEQIDNO:3+H120V、D、K、N，SEQIDNO:3+S124M，SEQIDNO:3+P129DSEQIDNO:3+E136Q，SEQIDNO:3+S143W，SEQIDNO:3+S161T，SEQIDNO:3+S163A、G，SEQIDNO.3+Y171L，SEQIDNO:3+A172S，SEQIDNO:3+N185Q，SEQIDNO:3+V199M，SEQIDNO:3+Y209W，SEQIDNO:3+M222Q，SEQIDNO:3+N238H，SEQIDNO:3+V244T，SEQIDNO:3+N261T，SEQIDNO:3+L262N、Q、D、ESEQIDNO:3+N76D+S163G+N238ESEQIDNO:3+S156D+L262ESEQIDNO:3+N238E+L262ESEQIDNO:3+S3T+N76D+S156D+Y209WSEQIDNO:3+H120D+S163G+N261DSEQIDNO:3+S163G+N128Q+N238E+L262ESEQIDNO:3+K27Q+H120D+S163G+N261DSEQIDNO:3+V104T+H120D+S156D+L262ESEQIDNO:3+G195E+V199MSEQIDNO:3+S3T+V4I+N261DSEQIDNO:3+A194P+G195E+V199M+V205ISEQIDNO:3+H120D+A228VSEQIDNO:3+S3T+V4I+A228VSEQIDNO:3+H120D+N261DSEQIDNO:3+H120D+S163G+N261DSEQIDNO:3+N76D+A228V+L262ESEQIDNO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N238ESEQIDNO:3+Q137H+S141H+R145H+N238E+L262ESEQIDNO:3+S3T+N76D+Q137H+S141H+R145H+S156D+Y209WSEQIDNO:3+H120D+Q137H+S141H+R145H+S163G+N261DSEQIDNO:3+N76D+Q137H+S141H+R145H+A228V+N261DSEQIDNO:3+A194P+G195E+V199M+V205I+A228V+N261DSEQIDNO:3+N62D+H120DSEQIDNO:3+H120D+N261DSEQIDNO:3+N76D+N261DSEQIDNO:3+N76D+A228V+N261DSEQIDNO:3+A194P+G195E+V205I+N261DSEQIDNO:3+N76D+H120D+N261DSEQIDNO:3+H120D+S163G+N261DSEQIDNO:3+S3T+Q59D+N76DSEQIDNO:3+S3T+N76D+H12...

【专利技术属性】
技术研发人员：MDGP托斯卡诺，EP弗里斯，RT伦哈德，SE拉森，A蒙克，BM卢，M鲍尔，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK