混合床离子交换吸附剂制造技术

本发明专利技术涉及新种类的离子交换吸附剂，其适合从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白(HCP)、抗体片段和低分子量物质。本发明专利技术特别涉及通过分离目标生物分子和杂质来纯化生物样品的方法，其包括使样品与由纤维组成的所述色谱介质接触的步骤，所述纤维具有赋予其上的能够实现离子交换色谱和/或疏水性相互作用的官能团。

Mixed bed ion exchange adsorbent

The present invention relates to a new kind of ion exchange adsorbent that is suitable for separating host cell proteins (HCP), antibody fragments and low molecular weight substances from a solution containing antibodies. The present invention relates to methods by separating the target molecules and impurities to purify biological samples, including samples to make contact with the chromatography medium composed of fibers of the steps, the fiber has conferred on can be achieved by ion exchange chromatography and / or hydrophobic interaction of functional groups.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】混合床离子交换吸附剂本专利技术涉及新种类的离子交换吸附剂，其适合从含有抗体的溶液中分离宿主细胞蛋白(HCP)、抗体片段和低分子量物质。本专利技术特别涉及通过分离目标生物分子和杂质来纯化生物样品的方法，其包括使样品与由纤维组成的所述色谱介质接触的步骤，所述纤维具有赋予其上的能够实现离子交换色谱和/或疏水性相互作用的官能团。背景纯化单克隆抗体因为单克隆抗体(mAb)用于药物应用，所以它们需要格外高的纯度[A.Jungbauer,G.Carta,ProteinChromatography,ProcessDevelopmentandScale-Up(蛋白色谱法，工艺开发和规模化);WILEY-VCHVerlag,Weinheim(德国)2010]。通常，采用哺乳动物细胞培养物来制造当前销售的大部分治疗单克隆抗体(mAb)。这些药物抗体的生产通常在含有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞悬浮液的生物反应器中开始，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞分泌抗体到细胞外流体中。所得抗体随后经受包括澄清、过滤和纯化的一系列过程，由此除去细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白(HCP)、脂质、DNA、病毒、细菌、抗体聚集体等。该系列过程常被称为下游过程(DSP)。最常用的DSP包括一个或两个结合-洗脱色谱纯化步骤，接着是一个或两个流通精制步骤(图1，标准mAb纯化方案)。典型的下游纯化方法采用填充有基于多孔珠的色谱介质的填充柱或基于膜的装置。这些单元操作串联使用，并且以流通精制或结合/洗脱捕获模式各自靶向清除特定杂质。精制介质的主要目的之一在于将HCP的浓度降低到<10ppm(就mAb浓度而言)。各种治疗生物分子的工业规模纯化目前使用基于珠粒的色谱树脂实现。生物药物生产商在该流通精制步骤中最常使用简单的阴离子交换(AEX)色谱介质。采用AEX介质以除去酸性HCP、DNA、内毒素和病毒。然而，其在除去带正电荷的杂质诸如碱性HCP、产物聚集体和片段方面常常不太有效。单克隆抗体继续赢得作为治疗和诊断剂的重要性。筛选候选mAB的杂交瘤库的方法既耗时又劳动密集。一旦建立了表达合适mAB的杂交瘤细胞系，则必须开发纯化方法以生产足够的mAB以便进一步表征。用于纯化的传统方法涉及使用蛋白A或蛋白G亲和色谱以及离子交换色谱。将纯化的抗体脱盐并使用透析交换到生物缓冲液中。整个过程通常需要几天才能完成，且如果需要平行地评估多个mAB，可能会特别繁重。因此，近来已经开发出多种新的精制吸附剂，其显示出更大的容量和亲和力，从而允许其除去更宽范围的杂质。这些吸附剂包括所谓的“混合模式”配体，既为阴离子交换材料(AEX)(例如US7,714,112)又为阳离子交换材料(CEX)(例如，US7,385,040)。然而，在树脂上的这些复杂配体的较高成本阻止了它们单次使用或在一次性使用过程中的使用。通常，所施用的基于珠粒的吸附剂证明了高孔隙率和大表面积，这为材料提供了足够的吸附能力以在生产规模(例如，10,000升)下分批加工生物分子。根据专利文献，已知在用于该技术应用的混合床固定相中使用的这种基于珠粒的介质的许多实例。在JP01-10178(AsahiChem.Ind.COLTD.，还作为JP2660261B2公开)中，公开了多功能模块，其包括用于在单一装置中除去阳离子、阴离子和细颗粒的目的的AEX和CEX多孔中空纤维膜的组合。Bio-RadLaboratories，Inc.已经开发了多介质亲和柱(US8,053,565B)，其包括在单一柱中在第二种类型的色谱介质之上的亲和色谱介质层，使得在洗脱目标亲和结合蛋白质的过程中该第二下部的色谱介质将捕获来自上部亲和色谱介质的任何浸出亲和配体。PromegaCorp.(US6,270,970A)已经开发了用于从不纯的混合物中分离核酸的混合床固相。所包含两相中的每一相具有在不同溶液条件下结合和释放靶核酸的能力。在由MilliporeCorp.和EbaraCorp.提交的另一专利申请(WO2005/011849A)中，公开了电去离子模块，其中离子交换装置由阴离子交换纤维的织物和以面对面关系放置的阳离子交换纤维的织物的组件构成。混合床色谱在单一装置中采用组合在一起的两种或更多种不同的吸附介质。其允许施用多种不同的相互作用以用于在单一装置内分析并纯化蛋白质溶液。Rassi和Horváth证实，由AEX-树脂和CEX树脂构成的混合床柱给出与串联的两个单独柱类似的蛋白质分离(elRassi,Z.;Harváth,C.;“Tandemcolumnsandmixed-bedcolumnsinhigh-performanceliquidchromatographyofproteins(在蛋白的高效液相色谱中的串联柱和混合床柱)”;J.Chrom.1986,359,255-264)。使用这些系统，他们能够拆分在仅采用单一树脂时将同时洗脱的几种不同蛋白质的混合物。已经将混合床色谱施用到包括蛋白组的分析的几种不同应用，蛋白组特别难以分析，因为它们由多种高丰度蛋白和低丰度蛋白构成(Boschetti,E.;Righetti,P.G.;“Mixed-bedchromatographyasawaytoresolvepeculiarfractionationsituations”,J.Chomatogr.B2011,897,827-835)。分离材料如色谱树脂通常呈现球形结构，该结构能够在最小流动不均匀性下实现有效柱填充。在珠粒之间的孔隙空间提供了经由色谱柱对流传输的流动通道。这使得色谱柱能够以大床深度以高线速度在最小压降下运行。这些因素的组合使得色谱树脂能够提供生物分子的大规模纯化需要的所需效率、高渗透性和足够的结合能力。在基于珠粒的色谱中，用于吸附的大部分可用表面积在珠粒内部。因此，分离过程本质上是缓慢的，因为质量传输速率通常通过孔扩散来控制。为了使该扩散阻力最小化并且同时使动态结合能力最大化，可采用小直径的珠粒。然而，使用该小直径珠粒是以增加的柱压下降为代价的。因此，制备型色谱分离的优化常涉及在效率/动态能力(小珠粒有利)和柱压下降(大珠粒有利)之间的折衷。色谱介质通常价格很高(>$1000/L)且大规模制备柱需要非常大的量。因此，生物医药生产商使色谱树脂再循环数百次。这些再生循环中的每次消耗大量的介质，且每个步骤产生与每次清洁、杀菌和柱填充操作的有效性关联的额外成本。如上所指出，数种技术描述于专利文献中且商业上面市以基于功能化纤维介质和/或复合材料进行生物医药分离。大多数依赖于将多孔凝胶合并到纤维基质中，凝胶提供所需的表面积以获得合理的结合能力。然而，在这样的构造中，凝胶位置和质量的不良均匀性通常引起不良效率(浅贯穿(shallowbreakthrough)和洗脱前沿(elutionfront))。另外，即使对于短床深度，流动阻力也可能很高，问题常常因在中度压力负载下的凝胶压缩而加剧。采用的另一方法是将微粒结合到纤维基质内，所述微粒常为多孔的并具有天然吸附官能团；实例是活性碳和硅胶。目的当前的下游过程(DSP)为复杂且昂贵的。这是为何工业对于开发压缩、简化且降低这些过程的成本的新技术感兴趣的原因。因此，目的在于开发通过消除在使用后清洁并储存管柱所需本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过分离目标生物分子和杂质来纯化生物样品的方法，其包括以下步骤：使所述样品与由纤维组成的色谱介质接触，所述纤维具有赋予其上的能够实现离子交换色谱和/或疏水性相互作用的官能团，和洗涤以除去未结合的物质或以提取所述目标生物分子的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.08 US 62/0890301.通过分离目标生物分子和杂质来纯化生物样品的方法，其包括以下步骤：使所述样品与由纤维组成的色谱介质接触，所述纤维具有赋予其上的能够实现离子交换色谱和/或疏水性相互作用的官能团，和洗涤以除去未结合的物质或以提取所述目标生物分子的步骤。2.根据权利要求1的方法，其用于纯化包含目标生物分子和杂质的样品，其包括以下步骤：a)提供样品，b)使所述样品与包含纤维的第一色谱介质接触，所述纤维具有赋予其上的能够实现离子交换色谱或疏水性相互作用色谱的官能团，c)洗涤所述第一纤维介质以除去未结合的物质，d)洗涤所述第一纤维介质以提取所述目标生物分子，e)使所述目标生物分子与包含纤维的第二色谱介质接触，所述纤维具有赋予其上的能够实现离子交换色谱或疏水性相互作用色谱的官能团，f)洗涤所述第二纤维介质以除去未结合的物质，和g)洗涤所述第二纤维介质以提取所述目标生物分子，但条件是在步骤b)和e)中使用不同官能化的纤维介质。3.根据权利要求2的方法，其中，在步骤b)中，使所述样品与包含纤维的第一色谱介质接触，所述纤维具有赋予的能够实现阴离子交换色谱的官能团，且其中，在步骤e)中，使用包含具有能够实现疏水性相互作用色谱的官能团的纤维的色谱介质。4.根据权利要求2的方法，其中，在步骤b)中，使所述样品与包含纤维的第一色谱介质接触，所述纤维具有赋予的能够实现阳离子交换色谱的官能团，且其中，在步骤e)中，使用包含具有能够实现疏水性相互作用色谱的官能团的纤维的色谱介质。5.根据权利要求2的方法，其中，在步骤b)中，使用包含具有能够实现疏水性相互作用色谱的官能团的纤维的色谱介质，且其中在步骤e)中的所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。6.根据权利要求2的方法，其中，在步骤b)中，使用包含具有能够实现疏水性相互作用色谱的官能团的纤维的色谱介质，且其中在步骤e)中的所述离子交换色谱为阳离子交换色谱。7.权利要求2的方法，其中在步骤b)中的所述第一色谱介质为阴离子交换色谱，且其中在步骤e)中的所述第二色谱介质为阳离子交换色谱。8.权利要求2的方法，其中在步骤b)中的所述第一色谱介质为阳离子交换色谱，且其中在步骤e)中的所述第二色谱介质为阴离子交换色谱。9.纯化包含目标生物分子和杂质的样品的方法，其包括以下步骤：a)提供样品，b)使所述样品与包含纤维的第一色谱介质和包含纤维的第二色谱介质的混合物接触，所述第一色谱介质包含具有赋予其上的能够实现离子交换色谱的官能团的纤维，所述第二色谱介质包含具有赋予其上的能够实现离子交换色谱的官能团的纤维，c)洗涤所述色谱介质的混合物以除去未结合的物质，和d)洗涤所述色谱介质的混合物以提取所述目标生物分子。10.权利要求9的方法，其中所述第一色谱介质为阴离子交换色谱，且所述第二色谱介质为阳离子交换色谱或者相反。11.纯化包含目标生物分子和杂质的样品的方法，其包括以下步骤：a)提供样品，b)使所述样品与包含纤维的第一色谱介质和包含纤维的第二色谱介质的混合物接触，所述第一色谱介质包含具有赋予其上的能够实现疏水性相互作用色谱的官能团的纤维，所述第二色谱介质包含具有赋予其上的能够实现离子交换色谱的官能团的纤维，c)洗涤所述色谱介质的混合物以除去未结合的物质，和d)洗涤所述色谱介质的混合物以提取所述目标生物分子。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：MT斯通，JP阿马拉，
申请(专利权)人：EMD密理博公司，
类型：发明
国别省市：美国,US