角蛋白纳米材料及其制备方法技术

本发明专利技术涉及角蛋白纳米材料,用于获得角蛋白纳米材料的方法,和由角蛋白纳米材料制备的生物材料。具体来说，披露了包含I型单体和II型单体对的角蛋白纳米材料，且披露了用于获得角蛋白纳米材料的方法，所述方法包含获得角蛋白溶液以及使用包含磷酸盐的缓冲溶液通过超滤来处理溶液。

Keratin nano material and preparation method thereof

The present invention relates to keratin nanomaterials, methods for obtaining keratin nanomaterials, and biomaterials prepared from keratin nanomaterials. Specifically, disclosed contains I monomer and II monomer of keratin nano materials, and discloses a method for obtaining keratin nano material, the method includes obtaining a keratin solution and buffer solution containing phosphate by ultrafiltration to treat solution.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】角蛋白纳米材料及其制备方法相关申请的交叉引用本申请要求2014年05月01日提交的美国临时专利申请号61/987,182,和2014年05月02日提交的美国临时专利申请号61/987,855的优先权和权益，以上各文的全部内容通过引用纳入本文。专利
本专利技术总体涉及角蛋白纳米材料领域,包含角蛋白纳米材料的生物材料,和制备角蛋白纳米材料的方法。具体来说，本专利技术涉及角蛋白纳米材料的制备和应用,其是包含紧密结合的角蛋白单体的二聚体和四聚体的大分子角蛋白复合物。专利技术背景中间纤维(IF)包含归属于6大类之一的属于α-螺旋蛋白质超家族的亚单位组件。通常,IF蛋白质具有共有二级结构特征，其可概括描述为包含中央α-螺旋结构域(domain)和头部和尾部球状结构域的单体形式。IF蛋白质中的中央α-螺旋结构域是高度保守的，且变化大部分来自头部和尾部结构域中一级结构的差异。为了形成中间纤维，这些单体物质聚合形成具有高度有序超结构的细长大分子复合物。两种主要IF蛋白质包含酸性和碱性角蛋白(分别是I型和II型IF蛋白质分类)。I型和II型角蛋白单体通常在上皮细胞中表达，且I型和II型角蛋白单体自身都不能装配成角蛋白纤维。I型和II型角蛋白单体通常以1:1比例结合来形成异二聚体，其进一步结合以组装成杂聚角蛋白纤维。角蛋白IF蛋白质可进一步描述为来自“软”上皮亚家族或来自“硬”毛囊细胞(trichocytic)亚家族。约有20种角蛋白(也称作细胞角蛋白)来自“软”亚家族，且由在上皮细胞中组成细胞骨架元件的胞内蛋白质组成。已知约17种角蛋白属于“硬”毛囊细胞亚家族,且这些角蛋白组成结构附加物，如蹄、指甲、毛皮、羽毛和头发纤维。研究表明蛋白质自组装过程对大分子复合物即二聚体和四聚体中的变化是非常敏感的。此外，仅仅存在损坏的蛋白质片段即可干扰自组装过程和/或打乱已经形成的超结构-对角蛋白蛋白质亦是如此。角蛋白单体形成特别强的大分子复合物，特别是在二聚体和四聚体水平，其不容易变性或分解成其单体单元。但是，使这些复合物变性的问题是，用于分解角蛋白超结构(主要是二硫键)的化学方法以及后续的蛋白质溶剂化技术可导致对角蛋白单体形成显著损坏。这种损坏通常不被觉察，且对角蛋白生物材料的形成、性质和性能是有害的。重组的角蛋白还没有对角蛋白生物材料领域提供任何有希望的替代，因为目前重组蛋白制备较困难和昂贵。到目前为止，整个角蛋白生物材料技术基于从例如头发纤维、羊毛、羽毛等的组织提取角蛋白。之前描述的角蛋白生物材料由角蛋白单体制成，通常在40-60千道尔顿(kDa)的范围，且没有披露使用纯化的角蛋白纳米材料。RouseJG,VanDykeME.《用于医疗应用的角蛋白基生物材料综述(Areviewofkeratin-basedbiomaterialsforbiomedicalapplications)》.《材料(Materials)》2010；3:999-1014；VanDykeME.《具有受控的机械、化学和生物性质的水凝胶及其制备方法(Hydrogelwithcontrollablemechanical,chemical,andbiologicalpropertiesandmethodformakingsame)》.美国专利号:7,001,987.2006年2月21日；VanDykeME,SaulJM,SmithTL,deGuzmanR.《受控的递送系统(Controlleddeliverysystem)》.美国专利申请公开号:2011/0217356.2011年03月7日提交。如本文所述，纯化的角蛋白纳米材料包括基本上不含结构损坏和缺陷以及与角蛋白纳米材料结合(即，连接到，粘结到等)的损坏蛋白质和肽的角蛋白。此外，描述将角蛋白用于制造先前所述的角蛋白生物材料的方法得到不是纯角蛋白纳米材料的分子复合物。甚至如上所述的“纯化角蛋白”包含具有紧密结合的损坏的蛋白质和蛋白质碎片(即肽)的角蛋白复合物，其对自组装过程是有害的，和/或在生物材料超结构形成之后使该生物材料超结构不稳定。VanDykeME.《含角蛋白生物材料的愈伤组合物(Woundhealingcompositionscontainingkeratinbiomaterials)》.美国专利号:8,273,702.2012年9月25日。已使用本领域普通技术人员熟知的方法通过氧化或还原从人类头发纤维提取角蛋白(参见，例如Crewther,W.G.等,《角蛋白化学(TheChemistryofKeratins)》.Anfinsen,C.B.,Jr.等，编者.《蛋白质化学进展(AdvancesinProteinChemistry)》1965,学院出版社(AcademicPress).纽约：191-346)。《蛋白质化学进展》中的这个章节包括参考了关于角蛋白的多过640篇出版的研究，并描述了提取角蛋白的方法。所述方法通常使用两步法，其中通过氧化或还原分解角蛋白的交联结构。如果使用氧化处理，所得角蛋白称作角质物质(keratose)，如果使用还原处理，所得角蛋白称作还原角蛋白。在这些反应中，裂解胱氨酸氨基酸残基中的二硫键，使角蛋白变成可溶解的。因为许多角蛋白仍然保留在角质层的保护性结构之内，通常使用利用变性溶液的第二步骤来实施皮质蛋白质的有效提取。或者，在还原反应的情况下，可组合这些步骤，或者可使用溶液，例如脲、硫脲、磷酸盐、磷酸氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸盐、碳酸氢盐、过渡金属氢氧化物、表面活性剂溶液，和/或其组合(例如浓度为0.1-1.0M的三(羟甲基)氨基甲烷的水性溶液，和0.1-10M的脲溶液)。文献还进一步表征，通过例如等电沉淀、超滤、层析及其组合的各种方法，角质物质和还原角蛋白的粗提取物可进一步精炼成α-角质物质,γ-角质物质,酸性α-角质物质,碱性α-角质物质,酸性γ-角质物质,碱性γ-角质物质,α-还原角蛋白,γ-还原角蛋白,酸性α-还原角蛋白,碱性α-还原角蛋白,酸性γ-还原角蛋白,碱性γ-还原角蛋白,和角蛋白结合的蛋白质(KAP)级分。在粗提取物中，α级分在低于pH6时开始沉淀，且到pH4.2时基本上完成沉淀。KAP级分通常与α级分共沉淀，由此形成α/KAP混合物。γ级分仍然在溶液中，但可通过添加非溶剂来沉淀。非溶剂是水互溶的，但不溶解角蛋白(例如乙醇)。可通过冷却乙醇且逐滴添加角蛋白溶液而不是将乙醇添加到角蛋白，来辅助γ级分的沉淀。这些分级步骤已在文献中描述且是本
所公知的；但是，这些方法不能形成本文所述的角蛋白纳米材料。此外，许多蛋白质纯化技术是本
所公知的，且包括分级沉淀到免疫亲和性层析(对于这个主题的更广泛的理解，参见ScopesR.K.(编者).《蛋白纯化：原理和实践(Proteinpurification:PrinciplesandPractice)》(第三版，施普林格(Springer),纽约.1993)；RoeS.,《蛋白质纯化技术：一种可行方法(Proteinpurificationtechniques:Apracticalapproach)》.(第二版.牛津大学出版社(OxfordUniversityPress),纽约.2001)；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种角蛋白纳米材料。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.01 US 61/987,182;2014.05.02 US 61/987,8551.一种角蛋白纳米材料。2.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，使用还原化学来制备所述角蛋白纳米材料。3.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，使用氧化化学来制备所述角蛋白纳米材料。4.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，其包含I型单体和II型单体对。5.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，其包含两(2)对I型单体和II型单体对。6.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，其包含二聚体和四聚体的混合物。7.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，其包含分子复合物，所述分子复合物基本上不含其它蛋白质和/或肽。8.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，所述纳米材料具有大于100kDa的分子量。9.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，所述纳米材料具有大于200kDa的分子量。10.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，所述纳米材料具有约50nm的长度和约1nm-5nm的直径的分子尺寸。11.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，所述纳米材料具有约50nm-100nm的长度和约5nm-10nm的直径的分子尺寸。12.如权利要求1所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，由可溶性角蛋白的溶液来制备所述纳米材料。13.如权利要求12所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，所述可溶性角蛋白的溶液主要包含氧化角蛋白。14.如权利要求12所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，所述可溶性角蛋白的溶液主要包含还原角蛋白。15.如权利要求12所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，从含角蛋白的材料提取所述可溶性角蛋白的溶液。16.如权利要求15所述的角蛋白纳米材料，其特征在于，所述含角蛋白的材料选自下组：头发、毛皮、羽毛、羊毛、蹄、嘴、角、爪、鳞片及其组合。17.由至少一种角蛋白纳米材料制备的一种生物材料。18.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述角蛋白纳米材料不含或基本上不含结合的蛋白质，且其中所述结合的蛋白质是损坏的或角蛋白蛋白质的片段。19.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述角蛋白纳米材料是还原的。20.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述角蛋白纳米材料是氧化的。21.如权利要求17或18所述的生物材料，其特征在于，所述角蛋白纳米材料是还原的纳米材料和氧化的纳米材料的组合。22.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述角蛋白纳米材料是分子量大于100kDa的二聚体,分子量大于200kDa的四聚体,或其组合。23.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述角蛋白纳米材料是具有约50nm的长度和约5nm的直径的二聚体,具有约50nm-100nm的长度和约10nm的直径的四聚体,或其组合。24.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是水凝胶。25.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是涂层。26.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是膜。27.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是海绵。28.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是泡沫。29.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是支架。30.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是油灰。31.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是胶粘剂。32.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是纤维。33.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是颗粒。34.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是溶液。35.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是敷料或敷料的组分。36.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是绷带或绷带的组分。37.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是药物递送装置。38.如权利要求17所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料是细胞递送装置。39.一种用于获得角蛋白纳米材料的方法，所述方法包括下述步骤：a.获得角蛋白溶液；和b.使用包含磷酸盐的缓冲溶液通过超滤来处理所述角蛋白溶液。40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述角蛋白溶液主要由氧化角蛋白组成。41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述角蛋白溶液主要由还原角蛋白组成。42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，使用具有30kDa的NLMWCO膜来进行所述超滤。43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，使用具有100kDa的NLMWCO膜来进行所述超滤。44.如权利要求39所述的方法，其特征在于，使用具有200kDa的NLMWCO膜来进行所述超滤。45.如权利要求39所述的方法，其特征在于，使用具有300kDa的NLMWCO膜来进行所述超滤。46.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述包含磷酸盐的缓冲溶液包含磷酸钠。47.如权利要求39所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·范戴克，M·B·拉夫曼妮，
申请(专利权)人：弗吉尼亚技术知识资产公司，
类型：发明
国别省市：美国,US