高效诱导人多能干细胞向心肌细胞分化的小分子化合物组合物制造技术

本发明专利技术公开了用于高效诱导人多能干细胞向心肌细胞分化的小分子化合物组合物，具体地，本发明专利技术提供了一种小分子化合物组合物，所述的小分子化合物组合物包括以下组分：(i)mTOR信号通路抑制剂；(ii)Wnt通路促进剂；和(iii)任选的，药学上可接受的载体。本发明专利技术的小分子化合物组合物能够高效地诱导多能干细胞转分化为心肌细胞，初筛的心肌细胞分化率高达86％，优化后的心肌细胞分化率高达98.3％。

Small molecule compound composition for efficiently inducing differentiation of human pluripotent stem cells into cardiomyocytes

The invention discloses a method for efficient induction of pluripotent stem cells to small molecular compound composition, myocardial cell differentiation in particular, the invention provides a composition of small molecule compounds, small molecule compounds the composition comprises the following components: (I) mTOR signaling pathway inhibitor; (II) Wnt pathway and (promoter; iii) optionally, a pharmaceutically acceptable carrier. The small molecular compound of the invention can efficiently induce the differentiation of multipotent stem cells into cardiomyocytes, the rate of differentiation of the screened cardiomyocytes is up to 86%, and the differentiation rate of the optimized cardiomyocytes is as high as 98.3%.

【技术实现步骤摘要】
高效诱导人多能干细胞向心肌细胞分化的小分子化合物组合物
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及用于高效诱导人多能干细胞向心肌细胞分化的小分子化合物组合。
技术介绍
心肌疾病是现代社会发病率和致死率最高的重大疾病之一，心肌缺血等疾病造成的心肌损伤属于不可逆的细胞死亡，至今仍缺少有效的治疗方式。自从人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多能干细胞(hiPS)被发现以来(统称人多能干细胞hPSC)，人多能干细胞来源心肌细胞成为心肌疾病治疗领域的新希望。除了用于细胞治疗以外，干细胞来源心肌细胞还可以用于心肌疾病治疗性药物筛选和药物心脏特异性毒性检测等重要方面。20年来，人多能干细胞定向分化和应用领域取得了突飞猛进的发展。早期获得心肌细胞的主要方法是将人胚胎干细胞与小鼠的内脏中胚层样细胞(Mousevisceralendoderm-likecell,END-2)共培养，或者通过拟胚体的(Embryonicbody，EB)的方法获得。这些诱导方法不但需要动物源性的血清，而且分化效率低下产量也非常低。2007年，CharlesMurry实验室建立了单层细胞分化系统，通过在RPMI1640和B27组成的基础分化液中添加促心肌分化细胞因子activinA和BMP4，在人胚胎干细胞系H7中达到30％的分化效率，但在人胚胎干细胞系H9中效率并不理想，只有不到5％。后期经过优化，即在分化早期加入Wnt3a，随后加入DKK1来调控Wnt信号通路的活性(先促进后抑制)，使分化效率有一定的提升，尤其是在H9中也达到30％的分化效率。虽然经过多年的发展，人胚胎干细胞心肌分化方法获得了长足的提升，然而分化效率仍有提升空间，分化的稳定性和在不同细胞系中的一致性也需要进一步提升，更重要的是分化成本和产量这些影响大规模生产的因素还需要进一步完善。因此，本领域迫切需要开发一种能大幅提高心肌细胞分化率的小分子化合物及其方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能大幅提高心肌细胞分化率的小分子化合物及其方法。本专利技术第一方面提供了一种小分子化合物组合物，所述的小分子化合物组合物包括以下组分：(i)mTOR信号通路抑制剂；(ii)Wnt通路促进剂；和(iii)任选的，药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述小分子化合物组合物包括以下组分：(i)mTOR信号通路抑制剂；和(ii)Wnt通路促进剂。在另一优选例中，所述组分(i)与组分(ii)的摩尔比为1-5000：5000-15000；较佳地为2-500：10000-12000；较佳地5-100：10000-12000；最佳地8-60：10000-12000。在另一优选例中，所述的组合物的使用浓度包括：组分(ii)Wnt通路促进剂的使用浓度为1-40uM，较佳地5-25μM，更佳地10-20μM。在另一优选例中，所述的组合物的使用浓度包括：组分(i)mTOR信号通路抑制剂的使用浓度为1-200nM，较佳地5-100nM，更佳地10-50nM。在另一优选例中，所述mTOR信号通路抑制剂选自下组：雷帕霉素(Rapamycin)、依维莫司(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、西替罗莫司(Temsirolimus)、INK128、地磷莫司(Ridaforolimus)、或其组合。在另一优选例中，所述Wnt通路促进剂包括：CHIR99021、BIO、或其组合。在另一优选例中，所述小分子化合物组合物还包括其他的心肌细胞分化促进剂。在另一优选例中，所述其他的心肌细胞分化促进剂包括AKT信号通路抑制剂LY99021。在另一优选例中，所述小分子化合物组合物为液态组合物，各组分的有效浓度如下所示：mTOR信号通路抑制剂：雷帕霉素(Rapamycin)：1nM-0.2μM，较佳地，5nM-0.1μM，更佳地，10nM-50nM；依维莫司(RAD001)：1nM-0.2μM，较佳地，5nM-0.1μM，更佳地，10nM-50nM；KU-0063794：1nM-0.2μM，较佳地，5nM-0.1μM，更佳地，10nM-50nM；AZD8055：1nM-0.2μM，较佳地，5nM-0.1μM，更佳地，10nM-50nM；Wnt通路促进剂：CHIR99021：1μM-12μM，较佳地，3μ-12μM，更佳地，10μM-12μM；Bio：0.5μM-2μM，更佳1μM—2μM。本专利技术第二方面提供了一种小分子化合物组合物的用途，用于(i)促进干细胞分化为心肌细胞。在另一优选例中，所述小分子化合物组合物还可用于(ii)提高干细胞的增殖水平；和/或(iii)抑制干细胞凋亡。在另一优选例中，所述增殖水平包括干细胞的增殖数量和干细胞的活性。在另一优选例中，所述干细胞选自下组：人诱导多能干细胞、胚胎干细胞、或其组合。在另一优选例中，所述干细胞不包括全能干细胞。在另一优选例中，所述干细胞来源于哺乳动物，较佳地为人、啮齿动物(如小鼠、大鼠)。在另一优选例中，所述干细胞包括人类多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells,hiPSC)。在另一优选例中，所述人类多能干细胞来源：皮肤成纤维细胞、尿液细胞、外周血细胞、或其组合。本专利技术第三方面提供了一种体外诱导干细胞分化为心肌细胞的方法，所述方法包括：(a)在分化诱导化合物的组合的存在下，在培养体系中培养干细胞系，从而获得所述的心肌细胞，其中所述的分化诱导化合物的组合包括(i)mTOR信号通路抑制剂；和(ii)Wnt通路促进剂。在另一优选例中，在所述培养体系中，所述组分(i)与组分(ii)的摩尔比为1-5000：5000-15000；较佳地为2-500：10000-12000；较佳地5-100：10000-12000；最佳地8-60：10000-12000。在另一优选例中，所述干细胞系包括多能干细胞系或专能干细胞。在另一优选例中，所述多能干细胞系包括人多能干细胞系。在另一优选例中，所述干细胞系选自下组：人胚胎干细胞系H9-cTnT-eGFP、H9、H7、人多能干细胞系U-Q1、或其组合。在另一优选例中，所述的培养为至少培养10代，较佳地，至少20代，更佳地，至少30-40代。在另一优选例中，在中胚层形成初始阶段(约为－3天)加入所述的分化诱导化合物的组合，并加以维持。在另一优选例中，所述的加入包括先后、同时加入(i)mTOR信号通路抑制剂；和(ii)Wnt通路促进剂。在另一优选例中，所述的“加入”包括先加入(ii)Wnt通路促进剂，然后加入(i)mTOR信号通路抑制剂。在另一优选例中，所述的“加入”使得所述培养体系中，(i)mTOR信号通路抑制剂的浓度为1-200nM，较佳地5-100nM，更佳地10-50nM；和/或(ii)Wnt通路促进剂的浓度为1-40μM，较佳地5-25μM，更佳地10-20μM。在另一优选例中，所述方法具有选自下组的一个或多个特征：(i)高心肌细胞分化率，所述分化率为85-99.9％，较佳地，90-98.5％；(ii)在培养过程中，每0.5ml的培养液中接种105个干细胞，可产生24×105个心肌细胞；在另一优选例中，所述方法还包括：(b)对步骤(a)得到的心肌细胞进行富集纯化。在另一优选例中，所述纯化条件包括：(a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子化合物组合物，其特征在于，所述的小分子化合物组合物包括以下组分：(i)mTOR信号通路抑制剂；(ii)Wnt通路促进剂；和(iii)任选的，药学上可接受的载体。

【技术特征摘要】
1.一种小分子化合物组合物，其特征在于，所述的小分子化合物组合物包括以下组分：(i)mTOR信号通路抑制剂；(ii)Wnt通路促进剂；和(iii)任选的，药学上可接受的载体。2.如权利要求1所述的小分子化合物组合物，其特征在于，所述mTOR信号通路抑制剂选自下组：雷帕霉素(Rapamycin)、依维莫司(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、西替罗莫司(Temsirolimus)、INK128、地磷莫司(Ridaforolimus)、或其组合。3.如权利要求1所述的小分子化合物组合物，其特征在于，所述Wnt通路促进剂包括：CHIR99021、BIO、或其组合。4.一种小分子化合物组合物的用途，其特征在于，用于(i)促进干细胞分化为心肌细胞。5.一种体外...

【专利技术属性】
技术研发人员：荆清，邱晓旭，刘洋，张一凡，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31