羊口疮疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于免疫疫苗技术领域，具体涉及一种羊口疮疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术的羊口疮疫苗的有效成分为由真核表达质粒pVAX1‑FIL，pVAX1‑B2L和pVAX1‑IL‑2组成的免疫原性组合物。所述羊口疮疫苗含有可以表达两个高度保守的羊口疮病毒基因的真核表达质粒和可以表达细胞因子IL‑2基因的真核表达质粒作为疫苗抗原，通过构建真核表达质粒作为DNA疫苗来预防羊口疮，该疫苗能够有效刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答，对新型羊口疮疫苗的研究具有重要的临床意义。

Sheep thrush vaccine and preparation method and application thereof

The invention belongs to the technical field of vaccine, in particular to a sheep oral vaccine and its preparation method and application. The effective components of the present invention ORF vaccine by eukaryotic expression plasmid pVAX1 FIL, pVAX1 B2L and pVAX1 immune IL consisting of 2 original compositions. Can cytokine expression of IL 2 gene eukaryotic expression plasmid as vaccine antigen eukaryotic expression plasmid and the expression of ORF vaccine contains two highly conserved ORFV gene, to construct eukaryotic expression plasmid DNA as a vaccine to prevent this vaccine to ORF, humoral and cellular immune responses to effectively stimulate the body to produce specific, has important clinical significance to study new ORF vaccine.

【技术实现步骤摘要】
羊口疮疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于免疫疫苗
，具体涉及一种羊口疮疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
羊口疮(Orf)，又名羊传染性脓疱、羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疱口炎，是由羊口疮病毒(Orfvirus，0rfV)引起的绵羊和山羊急性、高度接触性、嗜上皮性人兽共患传染病，羊口疮病毒为副痘病毒属成员之一，基因组全长134～139kb，中央编码区(ORFs009-111)较为保守。感染羊口疮病毒的羊以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征，不同地区分离的病毒抗原性不完全一致。感染羊口疮病毒的羊生产性能下降，采食困难、消瘦并长期带毒，给养羊业及饲养人员的健康带来严重的危害。该病几乎遍布全世界所有养羊的国家和地区，而且我国是该病流行严重的国家，每年感染ORFV的羊不少于500万只。羊口疮病毒(ORFV)的成熟病毒粒子呈砖形或椭圆形毛线团样外观，外层由较厚的囊膜包裹，与VACV相似也具有IMV、EEV等多种病毒粒子形式(Rzihaetal.,2003)。临床预防羊口疮的主要手段是接种疫苗，常用的有灭活苗和细胞弱毒苗，但存在产生抗体水平较低，免疫保护期短，不宜大量生产、储存的缺点。目前对该病尚无特效的治疗方法，只能采取临床外伤处置及支持疗法，在防控上国内外主要采取接种羊口疮弱毒活疫苗进行预防，但这种疫苗仍不能够彻底消除和控制该病，在免疫力和安全性方面均存在一定的缺陷，因此，创制安全、高效的新型疫苗势在必行，新型基因工程疫苗的研究具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种羊口疮疫苗及其制备方法和应用，所述羊口疮疫苗含有可以表达两个高度保守的羊口疮基因的真核表达质粒和可以表达细胞因子IL-2基因的真核表达质粒作为疫苗抗原，对新型羊口疮疫苗的研究具有重要的意义。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：免疫原性组合物，所述免疫原性组合物由真核表达质粒pVAX1-FIL，pVAX1-B2L和pVAX1-IL-2组成。进一步，所述真核表达质粒pVAX1-FIL中含有羊口疮病毒FIL的全基因编码序列，如SEQIDNO:1所示；所述真核表达质粒pVAX1-B2L中含有羊口疮病毒B2L的全基因编码序列，如SEQIDNO:2所示；所述真核表达质粒pVAX1-IL-2中含有山羊IL-2的全基因编码序列，如SEQIDNO:3所示。羊口疮病毒B2L基因是OrfV第11个开放阅读框，不同学者的研究表明，不同宿主和地区B2L基因仅在个别基因位点出现变异，其编码大小约为42kD病毒囊膜蛋白为重要的保护性抗原之一，可刺激机体中和抗体的产生和淋巴细胞的释放，可诱导机体产生强烈的免疫应答。羊口疮病毒F1L基因是OrfV第59个完整开放阅读框，编码39kD蛋白，是病毒表面的微管组成成分之一，能够介导细胞免疫和诱导机体产生中和抗体，还与病毒的吸附和侵入有关。虽然不同地区、不同宿主的OrfVF1L基因长度各不相同，但是F1L基因高度保守，F1L基因是OrfV新型疫苗研究中的一个重要免疫原性基因。白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一种最早发现的具有广泛生物活性的细胞因子，它能刺激T、B细胞生长增殖，激活T细胞分泌IFN-γ、CSF等，并增强Tc(CytotoxicTcel1)、NK、巨噬细胞的细胞毒活性，增强抗原提呈作用，是调节机体诱导免疫的重要细胞因子。由于它能够有效地提高免疫功能，医学上已用于预防和治疗一些常规方法难以治疗的疾病，如肿瘤等。进一步，所述真核表达质粒pVAX1-FIL，真核表达质粒pVAX1-B2L和真核表达质粒pVAX1-IL-2的OD260-280数值为1.8-2.0。进一步，所述真核表达质粒pVAX1-FIL、pVAX1-B2L和pVAX1-IL-2的体积比为1-2：1-2：1.5-3。作为一种优选，所述真核表达质粒pVAX1-FIL、pVAX1-B2L和pVAX1-IL-2的体积比为1：1：2。本专利技术的目的之二在于提供一种羊口疮疫苗，所述羊口疮疫苗的有效成分为以上所述的免疫原性组合物。临床预防羊口疮的主要手段是接种疫苗，常用的有灭活苗和细胞弱毒苗，但存在产生抗体水平较低，免疫保护期短，不宜大量生产、储存的缺点，不易大规模制备等原因而未能够进入临床应用。因此，新型基因工程疫苗的研究具有重要的意义，羊口疮病毒B2L与F1L基因二者均能引起机体产生免疫应答，同时与病毒的吸附和侵入有关，山羊IL-2能够有效地提高免疫功能，通过构建其真核表达质粒作为DNA疫苗来预防羊口疮能够有效刺激机体产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答，且核酸疫苗具有易于制备，具有重要的临床意义。进一步，所述羊口疮疫苗还包括药学上可接受的载体或助剂。本专利技术的目的之三在于提供一种所述的羊口疮疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)制备真核表达质粒pVAX1-FIL：a以pMD18T-F1L克隆质粒为模板，进行PCR目的基因F1L的扩增；b将得到的F1L基因和pVAX1载体均采用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，进行连接和转化，再经鉴定和提取，得基因真核表达质粒pVAX1-FIL；2)制备真核表达质粒pVAX1-B2L：a以pMD18T-B2L克隆质粒为模板，进行PCR目的基因B2L的扩增；b将得到的B2L基因和pVAX1载体均采用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，进行连接和转化，再经鉴定和提取，得基因真核表达质粒pVAX1-B2L；3)制备真核表达质粒pVAX1-IL-2：a提取山羊淋巴细胞中RNA，进行PCR目的基因IL-2的扩增；b将得到的IL-2基因与pMD19-T载体进行连接，再经转化得重组质粒；c采用HindⅢ和EcoRⅠ对pVAX1载体和重组质粒进行双酶切，得IL-2基因目的片段和pVAX1载体片段；d将得到的IL-2基因目的片段和pVAX1载体片段进行连接和转化，再经鉴定和提取，得基因真核表达质粒pVAX1-IL-2；4)按上述比例将真核表达质粒pVAX1-FIL、真核表达质粒pVAX1-B2L和真核表达质粒pVAX1-IL-2混合制剂，得羊口疮疫苗。进一步，所述真核表达质粒pVAX1-IL-2为提高免疫原性的佐剂。pVAXl载体是用于核酸疫苗的研究较多的载体之一，是美国FDA认可的可用于人的核酸疫苗研究的载体，其特征是携带强启动子Pc-MV和BGHployA信号，允许在大肠杆菌中进行高拷贝复制和在哺乳动物细胞中高水平瞬时表达的蛋白。pVAX1载体是在pcDNA3.1载体的基础上改造而成，该载体使用卡那霉素抗性基因替代pcDNA3.1载体的氨苄抗性基因，减少和人类基因重组的可能。由于pVAX1载体是一种非融合载体，要求插入序列中5'端含一个Kozak序列、起始密码子ATG和终止密码子TGA/TAG/TAA，以增强目的基因表达效率。本专利技术的目的还在于提供一种所述的免疫原性组合物或所述的羊口疮疫苗在制备预防羊口疮的药物中的应用。本专利技术的目的还在于提供一种预防羊口疮的组合物，所述组合物由表达F1L基因的真核表达质粒和/或表达B2L基因的真核表达质粒，表达IL-2基因的真核表达质粒组成。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的羊口疮疫苗，通过构建真核表达质粒作为DNA疫苗来预防羊口疮，所述羊口疮本文档来自技高网...

【技术保护点】
免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物由真核表达质粒pVAX1‑FIL，pVAX1‑B2L和pVAX1‑IL‑2组成。

【技术特征摘要】
1.免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物由真核表达质粒pVAX1-FIL，pVAX1-B2L和pVAX1-IL-2组成。2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述真核表达质粒pVAX1-FIL中含有羊口疮病毒F1L的全基因编码序列，如SEQIDNO:1所示；所述真核表达质粒pVAX1-B2L中含有羊口疮病毒B2L的全基因编码序列，如SEQIDNO:2所示；所述真核表达质粒pVAX1-IL-2中含有山羊IL-2的全基因编码序列，如SEQIDNO:3所示。3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述真核表达质粒pVAX1-FIL，真核表达质粒pVAX1-B2L和真核表达质粒pVAX1-IL-2的OD260-280数值为1.8-2.0。4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述真核表达质粒pVAX1-FIL、pVAX1-B2L和pVAX1-IL-2的体积比为1-2：1-2：1.5-3。5.羊口疮疫苗，其特征在于，所述羊口疮疫苗的有效成分为权利要求1-4任一项所述的免疫原性组合物。6.根据权利要求5所述的羊口疮疫苗，其特征在于，所述羊口疮疫苗还包括药学上可接受的载体或助剂。7.权利要求5所述的羊口疮疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备真核表达质粒pVAX1-FIL：a以pMD18T-F1L克隆质粒为模板，进行PCR目的基因F1L的扩增；b将得到的F1L基因和pVAX1载体均采...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲜思美，李鹏飞，冯将，刘嫒，李婷，张益，包细明，张素辉，许国洋，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52