一种用于VKORC1‑1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法技术

本发明专利技术提出了一种用于VKORC1‑1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法，首先采用氨基修饰的聚酰胺树枝状聚合物PAMAM处理纳米空心铂使其功能化得到PtPNPs‑PAMAM复合材料，然后将富勒烯纳米粒子，单链DNA信号探针与该复合材料混合，制得氧化还原探针；然后通过还原性氧化石墨烯四乙烯五胺，纳米金，亲和素，层层自组装用于生物素化的四面体DNA捕获探针的固定，从而制备了VKORC1‑1639G>A基因多态性检测的电化学传感器，该传感器成功的用于VKORC1基因发生单碱基突变的检测。本发明专利技术的优点在于灵敏度高，特异性强，检测迅速，方便。本发明专利技术为华法林个体化用药提供了新的检测方法。

An electrochemical sensor for the preparation method of VKORC1 1639G>A gene polymorphism detection

The invention provides a method for VKORC1 1639G> A electrochemical sensor for detecting gene polymorphism of preparation method, first uses the amino modified polyamide dendrimers PAMAM hollow nano platinum. The functionalized PtPNPs PAMAM composites, then Fuller graphene nanoparticles, single strand DNA probe signal is mixed with the composite material. Preparation of redox probe; and then through the reduction of graphene oxide four ethylene five amine, gold nanoparticles, avidin, self-assembly for tetrahedral DNA biotinylated capture probe is fixed, thereby producing VKORC1 1639G> A gene polymorphism detection of electrochemical sensor, the sensor is successfully used for the detection of single base mutations in the VKORC1 gene. The invention has the advantages of high sensitivity, strong specificity, rapid detection and convenience. The invention provides a new detection method for warfarin individualized medication.

【技术实现步骤摘要】
一种用于VKORC1-1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法
本专利技术涉及一种用于VKORC1-1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法，尤其是基于富勒烯纳米复合材料作为氧化还原探针制备的夹心型生物传感器，用于检测VKORC1-1639G>A基因多态性，属于电化学检测领域。
技术介绍
华法林是最广泛的抗凝剂，用于治疗中风，深静脉血栓形成，肺栓塞或严重冠状动脉血栓栓塞性疾病。然而，由于缺乏病人的个体遗传信息支持而导致每个病人对华法林预测剂量可能偏高或偏低。考虑到华法林的治疗指数狭窄，在给药剂量上存在较大的个体差异。因此，针对个体差异来精确调整华法林的用药剂量是非常必要的。这种用药差异因素是由针对华法林作用靶位点和个体的药物代谢酶的基因型来决定的。维生素K环氧化物还原酶复合亚基1(VKORC1)，是华法林的首要分子靶点。研究表明，VKORC1多态性对华法林的用药剂量有很大的影响，而多态性主要表现为1639G>A，1173C>T和1542G>C，其中，－1639AA基因型个体华法林的用药剂量明显低于其他基因型个体。基于此，基因型可以被简化为通过使用-1639G>A多态性作为预测华法林药效敏感性主要标志物。因此，依据病人的基因型来精确调整不同个体华法林的用药剂量，进而防止副作用的发生非常重要。传统对于VKORC1突变基因的检测主要依赖于聚合酶链式反应(PCR)和测序的方法。然而PCR的方法容易受到生物样品中复杂成分的影响，检测效率低和易出现假阳性而使其应用受到了限制。而DAN测序不仅需要专门的仪器设备，训练有素的工作人员而且检测过程繁琐费时，因此不适用于常规临床检测。最为主要的是，患者样品中突变序列相对于高水平野生型序列显得寡不敌众，很难获得较高的特异性。因此制备灵敏度高，特异性强的检测方法对于患者样品中低丰度突变基因的检测显得至关重要。近年来，基于纳米材料电化学生物传感器由于简便，快速，成本低，灵敏度高等优势而被广泛应用于生物样品的检测。在电化学生物分析中，信号放大对于提高DNA传感器的灵敏度是非常重要。但是核酸分子由于其本质是惰性分子，在生物测定反应中不能作为氧化还原电对。因此，氧化还原分子的有效固定在夹心型DNA生物传感器的构建中对于决定传感器的线性范围和检测限是关键的步骤。最近，纳米材料本身用作为氧化还原探针已被广泛研究，因为它不仅可有效克服氧化还原分子的泄漏，而且做为纳米载体可提高生物分子的固载量。新型纳米材料富勒烯(C60)，不仅具有大的比表面积和良好的生物相容性，同时也表现出优良的导电性。最重要的是，富勒烯具有强的电子接受能力以形成相应的阴离子物质，这使其可作为理想的氧化还原物质用于构建夹层型生物传感器。
技术实现思路
本专利技术基于C60纳米复合材料构建氧化还原探针，建立了一种用于VKORC1-1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法，为华法林的个体化用药提供了依据。为达到目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种用于VKORC1-1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法，其特征是包括以下步骤：(1)铂多空纳米粒子-聚酰胺树枝状聚合物-富勒烯纳米粒-单链脱氧核糖核酸(PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA)复合物DNA信号探针的制备；(2)四面体DNA捕获探针的合成；(3)利用PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA复合物DNA信号探针作为氧化还原探针，利用四面体的DNA捕获探针建立电化学DNA生物传感器，并对基因VKORC1-1639G>A进行检测。本专利技术中，所述PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNADNA复合物DNA信号探针的制备，包括以下步骤：(1.1)PAMAM-C60NPs纳米复合材料的制备：把1.0mg氨基修饰的聚酰胺树枝状聚合物溶于1mL双蒸水中，然后在上述溶液中加入4mL无水乙醇及1mL浓度为1.5mM的富勒烯甲苯溶液,室温搅拌36h，得到表面修饰有大量氨基的富勒烯悬液，然后5000转离心10min，用无水乙醇、双蒸水分别清洗3次，所得产物重新分散在2mL浓度为0.1M磷酸盐缓冲溶液中，备用；所述磷酸盐缓冲溶液的组分组成：浓度为0.1M的Na2HPO4、浓度为0.1M的KH2PO4、浓度为0.1M的KCl、其余是去离子水；pH=7.4；(1.2)PtPNPs-PAMAM-C60NPs纳米复合材料的制备：把5.6mg六水氯化钴（CoCl2·6H2O）和100mg的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶于50mL超纯水中，超声15min；然后在氮气（N2）中脱气15min，15mmol的硼氢化钠快速加入上述溶液中，搅拌，然后加入12mL质量百分比浓度为0.1%的氯铂酸（H2PtCl6），连续搅拌直到颜色变为黑褐色，然后将所得产物在旋转蒸发仪上干燥，得到空心铂；取干燥后的空心铂1mg重新分散在1mL超纯水中，配制成浓度为1mg/mL的空心铂溶液，4℃储存待用；在1mL浓度为1mg/mL的PAMAM-C60NPs溶液中加入1mL上述制备的空心铂溶液，4℃搅拌12h，所得溶液经8000/分钟，离心15min，并用超纯水清洗3次；(1.3)PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA复合物的制备：用高于巯基修饰的单链DNA片段100倍用量的三(2-氯乙基)磷酸酯室温处理巯基修饰的单链DNA片段，1h；将处理后的100mL浓度为100nM的DNA信号探针溶液（所述DNA为序列表中的SEQIDNO：6）加入1mL浓度为1mg/mL的PtPNPs-PAMAM-C60NPs溶液中，4℃搅拌12小时后离心，并用清洗缓冲液清洗，其中，所述清洗缓冲液的组分组成：浓度为10mM的Na2HPO4、浓度为2mM的KH2PO4、浓度为37mM的NaCl、浓度为2.7mM的KCl、其余是去离子水；pH为7.4；将合成的PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA重新分散在1mL杂交溶液中，4℃保存备用；其中，所述杂交溶液的组分组成：浓度为10mM的Na2HPO4、浓度为10mM的KH2PO4、浓度为20mM的NaCl、浓度为20mM的MgCl2、其余是去离子水；pH为7.4。本专利技术中所述的四面体DNA捕获探针的合成，其特征在于：将S1、S2、S3和S4四条单链DNA片段（所述DNA依次为序列表中的SEQIDNO：1、2、3和4）分别溶于TE缓冲液中，使每条单链DNA片段溶液的最终浓度为50mM；各取2mL的上述S1、S2、S3和S4单链DNA片段溶液与42mLTM缓冲液(20mMTris、50mMMgCl2、pH7.4)混合，将上述溶液置于95℃孵育5min，然后冷却至4℃并保持30s，以形成四面体DNA捕获探针溶液。本专利技术中所述的“利用PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA复合物DNA信号探针作为氧化还原探针，利用四面体的DNA捕获探针建立电化学DNA生物传感器，并对基因VKORC1-1639G>A进行检测”，其特征在于包括以下步骤：(3.1)分别用0.3mm和0.05mm的氧化铝（Al2O3）粉末将玻碳电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于VKORC1‑1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1) 铂多空纳米粒子‑聚酰胺树枝状聚合物‑富勒烯纳米粒‑单链脱氧核糖核酸 ( PtPNPs‑PAMAM‑C60NPs‑ssDNA)复合物DNA信号探针的制备；(2) 四面体DNA捕获探针的合成；(3) 利用PtPNPs‑PAMAM‑C60NPs‑ssDNA复合物DNA信号探针作为氧化还原探针，利用四面体的DNA捕获探针建立电化学DNA生物传感器，并对基因VKORC1‑1639G>A进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种用于VKORC1-1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)铂多空纳米粒子-聚酰胺树枝状聚合物-富勒烯纳米粒-单链脱氧核糖核酸(PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA)复合物DNA信号探针的制备；(2)四面体DNA捕获探针的合成；(3)利用PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA复合物DNA信号探针作为氧化还原探针，利用四面体的DNA捕获探针建立电化学DNA生物传感器，并对基因VKORC1-1639G>A进行检测。2.根据权利要求1所述的一种用于VKORC1-1639G>A基因多态性检测的电化学传感器制备方法，其特征在于，PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA复合物DNA信号探针的制备过程，具体包括以下步骤：(1.1)PAMAM-C60NPs纳米复合材料的制备：把1.0mg氨基修饰的聚酰胺树枝状聚合物溶于1mL双蒸水中，然后在上述溶液中加入4mL无水乙醇及1mL浓度为1.5mM的富勒烯甲苯溶液,室温搅拌36h，得到表面修饰有大量氨基的富勒烯悬液，然后5000转离心10min，用无水乙醇、双蒸水分别清洗3次，所得产物重新分散在2mL浓度为0.1M磷酸盐缓冲溶液中，备用；所述磷酸盐缓冲溶液的组分组成：浓度为0.1M的Na2HPO4、浓度为0.1M的KH2PO4、浓度为0.1M的KCl、其余是去离子水；pH=7.4；(1.2)PtPNPs-PAMAM-C60NPs纳米复合材料的制备：把5.6mg六水氯化钴和100mg的聚乙烯吡咯烷酮溶于50mL超纯水中，超声15min；然后在氮气中脱气15min，15mmol的硼氢化钠快速加入上述溶液中，搅拌，然后加入12mL质量百分比浓度为0.1%的氯铂酸，连续搅拌直到颜色变为黑褐色，然后将所得产物在旋转蒸发仪上干燥，得到空心铂；取干燥后的空心铂1mg重新分散在1mL超纯水中，配制成浓度为1mg/mL的空心铂溶液，4℃储存待用；在1mL浓度为1mg/mL的PAMAM-C60NPs溶液中加入1mL上述制备的空心铂溶液，4℃搅拌12h，所得溶液经8000/分钟，离心15min，并用超纯水清洗3次；(1.3)PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA复合物的制备：用高于巯基修饰的单链DNA片段100倍用量的三(2-氯乙基)磷酸酯室温处理巯基修饰的单链DNA片段，1h；将处理后的100mL浓度为100nM的DNA信号探针溶液（所述DNA为序列表中的SEQIDNO：6）加入1mL浓度为1mg/mL的PtPNPs-PAMAM-C60NPs溶液中，4℃搅拌12小时后离心，并用清洗缓冲液清洗，其中，所述清洗缓冲液的组分组成：浓度为10mM的Na2HPO4、浓度为2mM的KH2PO4、浓度为37mM的NaCl、浓度为2.7mM的KCl、其余是去离子水；pH为7.4；将合成的PtPNPs-PAMAM-C60NPs-ssDNA重新分散在1mL杂交溶液中，4℃保存备用；其中，所述杂交溶液的组分组成：浓度为10mM的Na2HPO4、浓度为10mM的KH2PO4、浓度为20mM的NaCl、浓度为20mM的MgCl2、其余是去离子水；pH为7.4。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁国林，王磊，张吉才，毛达勇，王芳，
申请(专利权)人：十堰市太和医院，
类型：发明
国别省市：湖北,42