本发明专利技术公开了东方巴贝斯虫1‑脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸还原异构酶基因，该基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，本发明专利技术还公开了所述基因所编码的蛋白，该蛋白具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明专利技术公开的重组蛋白可有效检测感染水牛血液中的东方巴贝斯虫病抗原的存在，具有良好的反应原性，有助于控制水牛的巴贝斯虫病在我国的流行和传播。
Oriental BABEI, 1 D worm deoxidation Mouton 5 sugar phosphate reductoisomerase gene and its encoding protein
The present invention discloses, BABEI 1 Oriental worm Mouton D deoxy sugar 5 phosphate reductoisomerase gene, this gene has the nucleotide sequence of SEQ ID NO:1 shows, the invention also discloses the gene encoding the protein, the protein has the amino acid sequence of SEQ ID sequence list is shown in NO:2. The recombinant protein disclosed by the invention can effectively detect potential infection in the blood of BABEI, buffalo Oriental worm disease antigen, has good immunogenicity, contribute to the control of buffalo, BABEI in the worm disease epidemic and spread in china.
【技术实现步骤摘要】
东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸还原异构酶基因及其编码的蛋白
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一个新基因及其重组蛋白，具体是指东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸还原异构酶(BoDXR)基因及其编码的重组蛋白，本专利技术还涉及重组蛋白的应用。
技术介绍
巴贝斯虫病又称梨形虫病、蜱热或德克萨斯热等，是由巴贝斯属的多种蜱传性，红细胞内寄生的原虫引起的。临床上主要引起多种脊椎动物的发热、血红蛋白尿、溶血性贫血和死亡。该病原属于顶复门，梨形虫纲，巴贝斯科，巴贝斯属的巴贝斯虫，最早于1888年，VictorBabes在患有血红蛋白尿和红色水热症状的牛红细胞内发现的该类微生物。目前，全世界大约有一半的养牛产业受到巴贝斯虫的威胁，给热带和亚热带国家的畜牧业造成了严重的经济损失。根据目前研究报告在我国南方的湖北、福建、江西、安徽、浙江、湖南、广西、云南、贵州等省份，引起水牛发病的主要是东方巴贝斯虫。该寄生虫具有严格地宿主特异性，仅感染水牛。它的传播媒介(镰形扇头蜱)是一种三宿主蜱，一年发生一代，可经卵传播东方巴贝斯虫。东方巴贝斯虫病主要在夏秋季节爆发，给畜牧业造成重大地经济损失。综合以上可看出，一旦某区域成为疫区，东方巴贝斯虫病便难以根治和清除，因此要控制该病的传播和流行，诊断和疫苗尤为重要。到目前为止，东方巴贝斯虫病的检测没有诊断试剂盒。因而筛选、鉴定具有良好免疫原性和反应原性的东方巴贝斯虫抗原便是解决途径之一。已知哺乳动物合成生命所需的类异戊二烯化合物采用的是甲羟戊酸途径，而东方巴贝斯虫合成类异戊二烯生物采用的是非甲羟戊酸途径，与哺乳动物的合成途径不一样，因而在东方巴贝斯虫体内克隆出1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸还原异构酶基因，构建原核表达载体，制备出多克隆抗体，筛选、鉴定出具有良好免疫原性和反应原性的东方巴贝斯虫抗原，对运用于临床检测东方巴贝斯虫病的感染情况具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是从东方巴贝斯虫中获得1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因。本专利技术的第二个目的是将所述东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因在大肠杆菌表达系统中高效表达获得重组蛋白。本专利技术的第三个目的是提供上述重组蛋白在制备东方巴贝斯虫病检测试剂盒中的用途。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：(1)东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因的获得：利用聚合酶链式反应(PCR)的方法，分别以东方巴贝斯虫全基因组和总RNA反转录成的cDNA为模板，经PCR得到1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶目的片段，其全基因核苷酸序列的开放阅读框(ORF)如序列表SEQIDNO：1所示。(2)编码了所述1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因的重组蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。(3)所述重组蛋白的制备方法为：将序列表SEQIDNO：1所示的东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶开放阅读框(ORF)与大肠杆菌表达载体构建重组表达质粒pE32a-BoDXR，电转化至BL21(DE3)中，抗生素氨苄青霉素筛选高抗性的转化子，并用0.2mmol/LIPTG于37℃诱导4h。收集上述IPTG诱导表达的菌液，对其进行分离纯化的蛋白即为编码了1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因的重组蛋白。(4)重组蛋白纯化处理：按上述方法诱导表达1000ml菌液，将表达的菌液转移到离心管于4℃条件下8000r/min离心10min集菌。取30mLbufferA(PH7.8)(Tris.base50mMEDTA0.5mMNaCl50mM甘油5％DTT5mM)重悬菌体沉淀后，使用压力破碎仪破碎3次；4℃，10000r/min离心5min，弃上清，收集沉淀，用PBS洗涤三次后，用包涵体纯化的方法提取蛋白。(5)多克隆抗体的制备：为制备BoDXR重组蛋白的抗血清，以纯化好的重组蛋白免疫5只4周龄的健康SPF昆明小鼠，免疫之前断尾采取血液0.5mL作为阴性对照，首次免疫将纯化好的100ug重组蛋白与完全弗氏佐剂乳化后，皮下注射，每只小鼠注剂量为200uL，在首次免疫后第14，21，28天分别以50ug纯化蛋白与不完全弗氏佐剂乳化后皮下多点注射加强免疫，在最后一次免疫后第7天采集抗血清。(6)本专利技术获得的重组蛋白具有生物活性，具有良好的反应原性。以制备的多克隆抗体为一抗，然后分别以东方巴贝斯的全虫抗原虫和健康的水牛红细胞反应为抗原，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Westernblot分析，检测重组表达蛋白的反应原性，结果显示仅东方巴贝斯虫全虫抗原有特异性的反应带，健康水牛红细胞无反应，所以制备的重组蛋白可用来有效地检测东方巴贝斯虫病。本专利技术的有益效果：本专利技术涉及的编码的东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶的重组蛋白可有效检测感染水牛血液中的东方巴贝斯虫病抗原的存在，具有良好的反应原性，有助于控制水牛的巴贝斯虫病在我国的流行和传播。附图说明图1为东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸还原异构酶基因扩增电泳图。1：从东方巴贝斯虫gDNA中扩增到目的基因；2：从东方巴贝斯虫cDNA中扩增到目的基因；3：阴性对照M：DNA分子量标准。图2为专利技术重组质粒的PCR扩增电泳图。所用引物是载体上的通用上游引物T7和目的基因的下游引物BoDXR-R2，1、2为挑取的两个阳性克隆子扩增后的目的片段；M：DNA分子量标准。图3为本专利技术重组质粒双酶切产物电泳图。1、2均为使用BsaIXhoI(购自NEB生物公司)表达引物扩增产物酶切后的目的片段；M：DNA分子量标准。图4为东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸还原异构酶的重组表达产物定性分析的SDS-PAGE电泳结果。1、3：未IPTG诱导的pET32a-BoDXR表达产物；2、4：诱导的pET32a-BoDXR；M：蛋白质分子质量标准。图5为东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸还原异构酶的重组表达产物的SDS-PAGE电泳结果，图5A为可溶性分析SDS-PAGE电泳结果，图5B为纯化产物的SDS-PAGE电泳结果。1：未经IPTG诱导的pET32a-BoDXR表达产物；2：经IPTG诱导的pET32a-BoDXR表达产物；3：表达菌裂解液的上清；4：表达菌裂解液的包涵体；5：纯化后的重组表达产物；M：蛋白质分子质量标准。图6为东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸还原异构酶重组蛋白的Westernblot鉴定。6A鉴定BoDXR的正确表达；6B鉴定制备的多克隆抗体的质量；6C和6D鉴定体内和体外的BoDXR蛋白表达形式是一样的；1：BoDXR未经IPTG诱导；2：纯化后的rBoDXR蛋白；3：B.orientalis裂解物；4：水牛健康红细胞。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。实施例1东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐酸-5磷酸还原异构酶基因的克隆1：东方巴贝斯虫的纯化及全虫抗原的提取东方巴贝斯虫的纯化：将新鲜收集的染虫红细胞(染虫率约5～10％)装入一灭菌的含EDTAk抗凝剂的无RNase的离心管中，细胞间转移到15mL离心管中，3000rpm离心6min，去除上清与表面的白色絮状物(白细胞)；加入血细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
东方巴贝斯虫1‑脱氧‑D‑木桐糖‑5‑磷酸还原异构酶基因，该基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸还原异构酶基因，该基因具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的东方巴贝斯虫1-脱氧-D-木...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺兰，赵俊龙，何沛，周艳琴，方瑞，申邦，胡敏，喻龙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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