一种基因定位整合表达系统及其应用技术方案

本发明专利技术涉及一种基因定位整合表达系统及其应用。具体地，涉及一种核酸构建物在转基因羊基因组中特定位点的整合与高效表达，所述核酸构建物包含与所述染色体区域结合的同源臂序列，以及位点特异性重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒。将所述构建物导入宿主细胞，可以实现目的基因在宿主细胞基因组中的定位整合与表达，获得转基因细胞，并以转基因细胞为核供体获得表达目的基因的转基因羊。利用位点特异性重组技术，可以在所述转基因羊体细胞中，实现其它特定外源基因的表达及转基因的遗传修饰。

Gene positioning integrated expression system and application thereof

The present invention relates to a gene targeting integrated expression system and its application. Specifically, relates to an integration point specific nucleic acid constructs in transgenic sheep genome and high expression, the nucleic acid constructs containing homologous arm sequences combined with the chromosomal regions, and expression of exogenous gene site-specific recombination sequence, and marker gene expression cassette box. The building into a host cell, can realize the positioning of target gene in the genome of the host cell integration and expression of transgenic cells, and transgenic cells as nuclear donor transgenic sheep target gene expression. Using site-specific recombination techniques, expression of other specific foreign genes and genetic modification of transgenes can be achieved in transgenic sheep somatic cells.

【技术实现步骤摘要】
一种基因定位整合表达系统及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种利用基因工程技术制备的基因定位整合表达系统及其应用。
技术介绍
转基因动物表达的外源蛋白具有精确的转录后加工，翻译后修饰(糖基化，二硫键形成等)，表达产物在分子结构、理化性质各生物学功能等方面与天然蛋白更接近。在制备一些翻译后修饰较复杂的重组蛋白时，往往利用转基因哺乳动物表达系统产生的重组蛋白具有较好的活性。但是，与其它表达系统相比，实现重组蛋白在转基因动物中高表达存在研制周期长，综合成本高等问题，这主要是由于目前采用的随机转基因方法存在外源基因在基因组中的整合位点和拷贝数不可控、外源基因在动物体内表达不稳定，转基因动物个体之间表型差异等问题，严重制约了转基因动物表达系统的应用。研制高效、经济的转基因动物表达系统一直是生物工程
，尤其是转基因动物生物反应器领域的一个主要发展方向。研究表明，外源基因表达特性与其所处的基因位点密切相关，整合于常染色质区的外源基因一般能获得较好的表达，而当外源基因整合在异染色质附近时就会出现不表达或嵌合表达的现象。有数据显示拷贝数与表达水平之间没有明显联系，而整合位点则是影响表达的主要因素。在转基因鱼、转基因奶山羊和转基因奶牛中外源基因的整合与表达也因整合位点不同而存在差异。此外，转基因的随机整合还可能会引起插入突变，产生明显的表型效应。外源基因整合位点对于转基因的表达至关重要，开发一种高效转基因动物表达系统的必要条件是找到一个合适的区域用于外源基因定位表达。在以往的研究中，人们发现有一些基因位点可支持外源基因高表达，如β-肌动蛋白(β-actin)位点、次黄嘌呤磷酸(HPRT)位点等。但这些位点用于支持外源基因表达尚存在一些不足之处：β-肌动蛋白定点整合的转基因小鼠因β-肌动蛋白的缺失而产生了一些异常现象；次黄嘌呤磷酸(HPRT)位点位点位于X染色体上，在雌性动物中常会由于随机X染色体失活而导致该位点的失活。综上所述，本领域迫切需要开发适用于外源基因定位表达的整合位点，建立高效的定位整合表达系统。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供建立一种高效的转基因羊定位整合表达系统，解决因转基因整合位点、整合拷贝数不确定带来的外源基因表达不确定问题，使转基因表达变得可控可期。在本专利技术的第一方面，提供了一种核酸构建物，所述的构建物具有从5到3’的式I结构：A5-B5-C-B3-A3-D(I)式中，A5、B5、C、B3、A3、D分别为用于构成所述构建物的元件；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；A5为5’同源臂序列；B5为5’位点特异性重组序列；C为串联的、各自独立的外源基因表达盒和第一筛选标记基因的表达盒；B3为3’位点特异性重组序列；A3为3’同源臂序列；D为无或第二筛选标记基因的表达盒；并且，所述的5’同源臂序列和3’同源臂序列使得所述构建物与山羊染色体发生定点重组，且所述的定点重组的位点位于山羊5号染色体MICAL3和PEX26之间的区域(NC_022297.1第100383471-100500925位)”。在另一优选例中，所述的5’同源臂序列和3’同源臂序列分别结合于山羊5号染色体MICAL3和PEX26之间、且位于所述定点重组的位点(即重组位点)两侧的区域。在另一优选例中，所述的5’同源臂序列和/或3’同源臂序列的长度为200-5000bp，较佳地为500-3000bp，更佳地为1000-2000bp。在另一优选例中，所述的5’同源臂序列选自：(a1)SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；或(a2)与(a1)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的3’同源臂序列选自：(b1)SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；或(b2)与(b1)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的5’同源臂序列如下制备：以SEQIDNO：11和SEQIDNO：12为引物，以山羊基因组DNA为模板PCR扩增获得。在另一优选例中，所述的3’同源臂序列如下制备：以SEQIDNO：13和SEQIDNO：14为引物，以山羊基因组DNA为模板PCR扩增获得。在另一优选例中，所述的位点特异性重组序列选自下组：Loxp、和Flp。在另一优选例中，所述的5’位点特异性重组序列选自：(c1)SEQIDNO：3所示的核苷酸序列；或(c2)与(c1)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的3’位点特异性重组序列选自：(d1)SEQIDNO：4所示的核苷酸序列；或(d2)与(d1)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的外源基因选自下组：红色荧光蛋白基因、溶菌酶基因、人乳清白蛋白基因、全人源肿瘤细胞坏死因子单克隆抗体基因、绿色荧光蛋白基因、和血清白蛋白基因。在另一优选例中，所述的筛选标记选自下组：嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素S脱氨酶基因(bsr)、和新霉素基因。在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列的长度为1-100bp，较佳地为1-50bp；更佳地为1-20bp。在本专利技术的第二方面，提供了一种载体，所述的载体含有本专利技术第一方面所述的构建物。在本专利技术的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本专利技术第一方面所述的构建物，或其基因组整合有一个或多个本专利技术第一方面所述的构建物。在另一优选例中，所述的宿主细胞为人或非人哺乳动物的细胞。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自：山羊、绵羊、猪、牛、狗和兔，较佳地为山羊。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括山羊成体体细胞、山羊胎儿体细胞、或山羊胚胎干细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括山羊耳成纤维细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞是用选自下组的方法将本专利技术第一方面所述的构建物导入细胞的：同源重组法、显微注射法、电穿孔法、脂质体转染法、磷酸钙沉淀法、病毒感染法、或精子载体法。在本专利技术的第四方面，提供了一种体外制备转基因细胞的方法，包括步骤：(i)将本专利技术第一方面所述的构建物、或含有所述构建物的载体转染细胞，使得所述构建物与所述细胞中的染色体发生定点重组，从而制得转基因细胞，且所述的定点重组的位点位于山羊5号染色体MICAL3和PEX26之间的区域。在另一优选例中，在步骤(i)中，还包括用进行定点切割的构建物对所述细胞进行转染，从而对所述细胞的染色体进行定点切割，其中定点切割的位点位于山羊5号染色体MICAL3和PEX26之间的区域。在另一优选例中，所述定点切割的位点位于本专利技术第一方面所述定点重组的位点附近。在另一优选例中，所述的切割采用Talen切割方法。在另一优选例中，所述的Talen切割方法采用pTL和pTR质粒。在另一优选例中，所述的宿主细胞为人或非人哺乳动物的细胞。在本专利技术的第五方面，提供了一种制备转基因动物的方法，包括步骤：(i)将本专利技术第一方面所述的构建物、或含有所述构建物的载体转染细胞，使得所述构建物与所述细胞中的染色体发生定点重组，从而制得转基因细胞，且所述的定点重组的位点为山羊5号染色体MICAL3和PEX26之间的区域；和(ii)将获得的转基因细胞再生为动物体，从而获得转基因动物。在另一优选例中，步骤(ii)包括步骤：(ii-1)将所获得的转基因细胞作为核供体进行体细胞克隆，从而获得转基因动物。在本专利技术的第六方面，提供了一种体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸构建物，其特征在于，所述的构建物具有从5到3’的式I结构：A5‑B5‑C‑B3‑A3‑D  (I)式中，A5、B5、C、B3、A3、D分别为用于构成所述构建物的元件；各“‑”独立地为键或核苷酸连接序列；A5为5’同源臂序列；B5为5’位点特异性重组序列；C为串联的、各自独立的外源基因表达盒和第一筛选标记基因的表达盒；B3为3’位点特异性重组序列；A3为3’同源臂序列；D为无或第二筛选标记基因的表达盒；并且，所述的5’同源臂序列和3’同源臂序列使得所述构建物与山羊染色体发生定点重组，且所述的定点重组的位点位于山羊5号染色体MICAL3和PEX26之间的区域(NC_022297.1第100383471‑100500925位)。

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建物，其特征在于，所述的构建物具有从5到3’的式I结构：A5-B5-C-B3-A3-D(I)式中，A5、B5、C、B3、A3、D分别为用于构成所述构建物的元件；各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；A5为5’同源臂序列；B5为5’位点特异性重组序列；C为串联的、各自独立的外源基因表达盒和第一筛选标记基因的表达盒；B3为3’位点特异性重组序列；A3为3’同源臂序列；D为无或第二筛选标记基因的表达盒；并且，所述的5’同源臂序列和3’同源臂序列使得所述构建物与山羊染色体发生定点重组，且所述的定点重组的位点位于山羊5号染色体MICAL3和PEX26之间的区域(NC_022297.1第100383471-100500925位)。2.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的5’同源臂序列和3’同源臂序列分别结合于山羊5号染色体MICAL3和PEX26之间、且位于所述定点重组的位点(即重组位点)两侧的区域。3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的5’同源臂序列和/或3’同源臂序列的长度为200-5000bp，较佳地为500-3000bp，更佳地为1000-2000bp。4.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的位点特异性重组序列选自下组：Loxp和Flp。5.一种载体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：成国祥，俞慧清，陈建泉，陆平，
申请(专利权)人：上海杰隆生物工程股份有限公司，上海转基因研究中心，
类型：发明
国别省市：上海,31