一种茶皂素有效部位的制备及其抗家畜病毒的新用途制造技术

本发明专利技术提供了一种利用胆甾醇或谷甾醇沉淀法精制茶皂素类成分的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：a、将油茶籽饼水煎煮后，过滤后得到水提取液。b、水提取液上大孔树脂，醇‑水溶液梯度洗脱，收集20％乙醇以下的洗脱部位。c、对b得到洗脱部位减压至干，残渣适量乙醇水溶液溶解后加入胆甾醇或谷甾醇的乙醇溶液至不再析出沉淀。d、对c得到的沉淀物干燥后，用丙酮混悬，抽滤，滤饼少量丙酮润洗后，干燥得到茶皂素有效部位产品。本发明专利技术还提供一种茶皂素有效部位(TS)预防和治疗家畜病毒性感染疾病的药物组合物，对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)具有较好的选择性抑制和杀伤效果。

Preparation of tea saponin effective part and its new use for resisting domestic animal virus

The invention provides a preparation method of precipitation purification of tea saponin compounds using cholesterol or sitosterol, characterized in that the method comprises the following steps: A, the camellia seed cake water decocted, filtered water extract. B, water extract on macroporous resin, alcohol aqueous solution with gradient elution, collecting 20% ethanol elution parts below. C and B can be eluted to dry, the residue is dissolved in ethanol solution, and the alcohol solution of cholesterol or sterol is added until the precipitate is no longer precipitated. D, C of the precipitate obtained after drying with acetone suspension filtration, filter cake, a small amount of acetone run after washing, drying to obtain the effective parts of tea saponin products. The invention also provides a kind of effective parts of tea saponin (TS) drug composition of livestock disease prevention and treatment of viral infection, syndrome virus of porcine reproductive and respiratory disorders (PRRSV) has good selective inhibition and killing effect.

【技术实现步骤摘要】
一种茶皂素有效部位的制备及其抗家畜病毒的新用途
本专利技术涉及一种茶皂素有效部位的制备方法和其抗家畜病毒的新用途，具体涉及一种茶皂素有效部位预防或治疗家畜病毒性感染疾病的应用，属于药物化学领域。
技术介绍
目前猪、鸡等家畜养殖是我国广大农民致富的主要途径，但猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)等是造成妊娠母猪的繁殖障碍和仔猪夭折等多种家畜致病的重要原因，具有较高的发病率和死亡率。然而，有效抑制病毒感染和降低病毒致死率方面的药物比较少，研制出新型、有效、安全的具有预防和治疗家畜病毒感染性疾病功能疗效的药物具有重大意义。茶皂素(Teasaponia)是油茶籽饼中提取的一种五环三萜类化合物。随着茶皂素的应用研究工作不断深入，茶皂素在日用化工、轻纺、及医药行业中的应用亦愈来愈广泛。特别是近年来的药理活性研究发现，茶皂素具有杀灭病毒、抗菌消炎、抗氧化、抗高血压、抑制酒精吸收保护肠胃、以及杀虫驱虫等药理学功能。但油茶籽饼中茶皂素类成分极性大，易溶于水，从水溶液中富集困难，且其抗家畜病毒的文献鲜有报道，本专利技术提供了一种茶皂素有效部位的制备方法和其抗家畜病毒的新用途。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种利用胆甾醇或谷甾醇沉淀法精制茶皂素类成分的制备方法。本专利技术的另一个目的在于提供一种预防和治疗家畜病毒性感染疾病的药物组合物。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的：油茶籽饼6-10倍量水煎煮提取后，提取液通过D型大孔吸附脂柱，依次用不同比例的乙醇-水溶剂梯度洗脱，将20％乙醇以下的洗脱部位减压浓缩至干，残渣用适量乙醇水溶解，加入胆甾醇或谷甾醇的乙醇溶液至不再析出沉淀。沉淀用丙酮混悬，抽滤，滤饼用少量丙酮润洗后，干燥得到茶皂素有效部位。上述水洗脱液减压蒸干后，残渣用适量乙醇水溶解，乙醇溶度为1％～95％。上述水洗脱液减压蒸干后，残渣用适量乙醇水溶解后，残渣浓度为：1mg/mL～100mg/mL。上述残渣用乙醇水溶解后，加入的胆甾醇或谷甾醇乙醇溶液浓度为：1mg/mL～40mg/mL。进一步，所述应用为预防或治疗家畜病毒性感染疾病。进一步，所述抗病毒性感染疾病的病原微生物主要包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和伪狂犬病毒(PRV)等。本专利技术还提供一种预防或治疗家畜病毒性感染疾病的药物组合物，该组合物包括茶皂素有效部位或其盐以及药学上可接受的辅料。进一步，所述抗病毒药为利巴韦林、拉米夫定、阿昔洛韦、阿德福韦酯、奥司他韦、或奈非那韦中的任一一种或几种。本专利技术进一步提供一种具有抗病毒作用的药剂盒，该药剂盒由治疗有效量的茶皂素有效部位及常规抗病毒药组成。所述常规抗病毒药为利巴韦林、拉米夫定、阿昔洛韦、阿德福韦酯、奥司他韦、或奈非那韦等临床常用一线、二线抗病毒药物。本专利技术所述“药学上可接受”指用于家畜时生理上可耐受且通常不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。所述“治疗有效量”指用药剂量足以引起宿主中临床显著病症/症状的改善。具体实施方式本专利技术以下将结合实施例作进一步详述，但并不限制本专利技术。制备实施例1茶皂素有效部位的制备按重量比取油茶籽饼10份加入到80份水中，倒入容器中浸泡30分钟，煎煮提取40分钟，过滤后得到茶皂素水煎提取液；将提取液通过D型大孔吸附树脂柱(D型大孔吸附树脂先用丙酮处理后装柱)，用90％乙醇、60％乙醇、40％乙醇和水梯度洗脱，收集水洗脱部位，减压浓缩至干，得残渣。取上述残渣100g，溶于50mL70％乙醇，搅拌下加入10mg/mL胆甾醇的乙醇溶液，至不在有絮状沉淀产生，静置抽滤，滤饼适量蒸馏水洗，干燥。取干燥物混悬于适量丙酮中，抽滤，滤饼用少量丙酮润洗，干燥后得到淡褐色粉末64.9g，即为茶皂素有效部位。制备实施例2茶皂素有效部位的制备按重量比取油茶籽饼10份加入到80份水中，倒入容器中浸泡30分钟，煎煮提取40分钟，过滤后得到茶皂素水煎提取液；将提取液通过D型大孔吸附树脂柱(D型大孔吸附树脂先用丙酮处理后装柱)，用90％乙醇、60％乙醇、40％乙醇和水梯度洗脱，收集水洗脱部位，减压浓缩至干，得残渣。取上述残渣100g，溶于50mL70％乙醇，搅拌下加入10mg/mL谷甾醇的乙醇溶液，至不在有絮状沉淀产生，静置抽滤，滤饼适量蒸馏水洗，干燥。取干燥物混悬于适量丙酮中，抽滤，滤饼用少量丙酮润洗，干燥后得到淡褐色粉末64.9g，即为茶皂素有效部位。效果实施例一茶皂素有效部位抗PRRSV病毒活性研究1仪器与材料1.1病毒来源PRRSV病毒由高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征活疫苗1.2试验药物实验药物：茶皂素有效部位对照药物：利巴韦林1.3仪器Thermo3111型CO2培养箱；HFsafe生物安全柜；MultiskanGO酶标仪；京立牌LD5-2B型台式低速离心机；OlympusIX71倒置荧光显微镜改良型；RPMI-1640培养基、胎牛血清、马血清、0.25％胰蛋白酶溶液、噻唑蓝、磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；Amresco二甲基亚砜(DMSO)。Marc-145细胞衍生于非洲绿猴肾细胞，购于中国兽医药品监察所。2方法2.1细胞传代培养Marc-145细胞于37℃、5％CO2环境中生长，3-4天后，待细胞长至瓶底面积的90％以上，即可继续传代培养；新复苏的细胞连续传代3次以上才可接种到细胞培养板中进行后续试验。2.2细胞培养板模型建立Marc-145细胞密度为2×104个/mL，按试验要求接种到96孔板中，每孔100μL细胞悬液；接种于6孔板中，每孔2mL；接种到384孔板中，每孔20μL；在37℃、5％CO2环境培养，待孔内细胞生长达到底壁90％以上备用。2.3PRRSV来源高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒活疫苗(JXAI-R株)，生产批号为1012001，由广东大华农动物保健品股份有限公司提供。2.3.1PRRSV扩增待Marc-145细胞培养至单层后，取适量稀释好的病毒液接种到单层细胞上(25cm2细胞培养瓶内约加入2ml)，轻轻转动培养瓶使病毒液完全覆盖住细胞单层。培养2.5h后，弃掉病毒液，PBS冲洗3次，加入2％细胞维持液继续培养，细胞病变率达到80-90％时收集病毒液。2.3.2PRRSV收获把病变细胞在-20℃和4℃间反复冻融3次，3000rpm离心细胞培养液30min，收集上清液，经0.22μm微孔滤膜除菌，分装到冻存管内，-80℃过夜，之后转入液氮长期保存。2.4试验方法2.4.1PRRSV毒力测定Marc-145细胞消化后，将细胞密度调至2×105/ml后接种到96孔板内，每孔100μl，置于37℃5％CO2培养箱中培养。待细胞长至单层，每孔分别接种10-1-10-9100μl病毒液，每个滴度重复8次，继续培养120h。每天观察并记录细胞的病变效应(cytopathiceffect，CPE)和病毒的半数感染量(tissuecultureinfectivedose，TCID50)，按照Reed-Muench公式计算。2.4.2药物的细胞毒性测定首先将供试药品溶于1％的DMSO中，配置成DMSO储备液用于后续试验。移液枪吸取4μl1％的供试药品储备液放入1.5EP管内，加入396μl细胞维持液，倍比稀释8个梯度，分别加入长成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶皂素的制备方法，其特征在于：该方法依次包括下述步骤：a、将油茶籽饼水煎煮后，过滤后得到水提取液。b、水提取液上大孔树脂，醇‑水溶液梯度洗脱，收集20％乙醇以下的洗脱部位，减压浓缩至干。c、对b得到的残渣用适量乙醇水溶解后加入胆甾醇或谷甾醇乙醇水溶液至不在析出沉淀。d、对c得到的沉淀物干燥后，用丙酮混悬，抽滤，滤饼少量丙酮润洗后，干燥得到茶皂素有效部位产品。

【技术特征摘要】
1.一种茶皂素的制备方法，其特征在于：该方法依次包括下述步骤：a、将油茶籽饼水煎煮后，过滤后得到水提取液。b、水提取液上大孔树脂，醇-水溶液梯度洗脱，收集20％乙醇以下的洗脱部位，减压浓缩至干。c、对b得到的残渣用适量乙醇水溶解后加入胆甾醇或谷甾醇乙醇水溶液至不在析出沉淀。d、对c得到的沉淀物干燥后，用丙酮混悬，抽滤，滤饼少量丙酮润洗后，干燥得到茶皂素有效部位产品。2.如权利要求1所述的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷鹏程，王鹏龙，李宏全，孙耀贵，李娥，
申请(专利权)人：雷鹏程，
类型：发明
国别省市：北京,11