一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法技术

本发明专利技术公布了一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法，包括步骤一，剥离小麦成熟胚接种到培养基Ⅰ上诱导小麦成熟胚萌发芽体。步骤二，将小麦成熟胚萌发芽置于培养基Ⅱ上诱导萌发芽体不定芽产生；步骤三，将步骤二的得到的整丛不定芽转接于培养基Ⅲ上促进不定芽的生长、发育；步骤四，从步骤三得到的整丛不定芽中，取单个不定芽置于培养基IV中壮苗生根得到小麦幼苗；所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ及培养基IV均自行研制。本发明专利技术首次提出一种利用小麦成熟胚萌发芽体为材料，诱导小麦丛生芽的方法，建立起了一种高效的小麦丛生芽诱导技术体系，该技术体系克服了小麦不定芽诱导难、诱导效率低、稳定性差的弊端。

Method for inducing multiple shoots of Wheat by germination bud of mature wheat embryo

The invention discloses a method for inducing a multiple bud of Wheat by using a mature embryo bud of wheat, which comprises the steps of: stripping the mature wheat embryo and inoculating the culture medium to induce the mature embryo bud of wheat. Step two, the germination of mature wheat embryo culture medium in the adorable adorable body of inducing adventitious buds germination; step three, step two will get the whole bundle of adventitious buds in the medium of transfer to promote adventitious bud growth and development; step four, from step three the whole bundle of adventitious buds, from a single seedling adventitious buds into the culture medium IV got rooting wheat seedlings; the medium medium I, II, III culture medium and culture medium were developed by IV. The present invention proposes a use of mature wheat embryo germination adorable as materials, wheat bud induction method, establish an efficient wheat bud induction technology system, the system overcomes the difficult, adventitious bud induction of Wheat Induced by low efficiency and poor stability of disadvantages.

【技术实现步骤摘要】
一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法
本专利技术属于作物遗传育种
，涉及小麦丛生芽离体诱导技术，具体涉及一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法。
技术介绍
小麦是重要的粮食作物，在我国是仅次于水稻和玉米的第三大类作物，小麦生产在我国国民经济中占有重要地位。品种改良是小麦生产的重要基础，近年来，随着分子生物学技术的发展，分子育种已成为现代作物育种重要的方法之一，但作为小麦基因工程改良的重要受体---小麦各种愈伤组织的再生难、转化效率低、成本高已成为普及小麦遗传转化改良技术的技术瓶颈，探求新的、高效的、低成本、能广泛应用的小麦遗传转化新途径是小麦分子改良技术大众化当务之急。不定芽是经离体诱导，从植物组织单细胞进一步分化出来的芽体，经生根诱导可发育成一个正常植株，通过农杆菌介导转化的植物组织细胞，经过转化细胞的筛选和诱导不定芽的再生，是烟草等重要作物遗传转化获得转化植株的主要方法，该方法具有转化成本低、效率高、操作简单等诸多优点；小麦是单子叶作物，尽管小麦在苗期能进行大量分蘖，但小麦芽、苗离体培养条件下几乎不产生不定芽苗，研究合适的诱导前体，建立小麦高效的不定芽离体诱导技术体系，将为小麦分子遗传育种中的遗传转化找到新的、高效的、低成本大众化应用的技术方法和途径。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术提出一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法，本专利技术建立了小麦不定芽离体诱导技术体系，克服了小麦不定芽诱导难、诱导效率低、稳定性差的弊端。为解决上述问题，本专利技术采用的技术方案是：一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法，包括如下步骤：步骤一，剥离小麦成熟胚接种到培养基Ⅰ上诱导小麦成熟胚萌发芽体。步骤二，将步骤一得到的萌发芽体置于培养基Ⅱ上诱导小麦成熟胚萌发芽体不定芽产生；步骤三，，将步骤二的得到的整丛不定芽置于培养基III上进行培养进一步促进不定芽的生长；步骤四，从步骤三经培养基III培养后的整丛不定芽中，取单个不定芽置于培养基IV中进行培养得到小麦幼苗；所述培养基Ⅰ为向1LMB5基本培养基中附加质量浓度为4mg/LTDZ(噻二唑苯基脲)、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂。所述培养基II为向1LMB5基本培养基中加入1mg/LTD(噻二唑苯基脲)Z、1mg/L6-BA(6—苄基氨基嘌呤)、2mg/LKT(6—呋喃基氨基嘌呤)、0.1mg/L2,4-D(2,4—二氯苯氧乙酸)、0.5mg/LIAA(吲哚乙酸)、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂、300mg/L水解酪蛋白、250mg/L天门冬酰胺和200mg/L谷氨酰胺；所述培养基III为向1LMB5基本培养基中加入1mg/LTDZ(噻二唑苯基脲)、0.5mg/LIAA(吲哚乙酸)、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂、300mg/L水解酪蛋白、250mg/L天门冬酰胺和200mg/L谷氨酰胺；所述培养基IV为向1L1/2MB5基本培养基中加入0.5mg/LIAA(吲哚乙酸)、25g/L蔗糖和6.5g/L琼脂。小麦成熟胚获取包括：取当年收获或储藏1年的小麦种子，依次经无菌水冲洗、质量分数为70％酒精消毒、0.1％HgCl2消毒、无菌水冲洗后侵于温水中过夜，待小麦种子吸胀后，依次经70％乙醇漂洗、0.1％HgCl2消毒、无菌水冲洗后剥取小麦成熟胚接种。所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ和培养基ⅣpH值均为5.6。所述步骤一、步骤二、步骤三和步骤四的培养条件均包括：25℃～27℃温度、3000Lx-4000Lx光照。步骤二所述接种小麦成熟胚萌发芽体长度为0.5cm—0.6cm；步骤三经培养基Ⅱ培养的整丛不定芽的单个不定芽长度大约为0.1cm-0.2cm时转入培养基Ⅲ促进不定芽的进一步发育。与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：(1)本专利技术首次提出一种利用小麦成熟胚萌发芽体为材料，诱导小麦丛生芽的方法。(2)本专利技术通过萌发芽培养基、不定芽诱导、生长及壮苗生根培养基的研究、培养条件的研究，建立了一种高效的小麦丛生芽诱导技术体系，该技术体系克服了小麦不定芽诱导难、诱导效率低、稳定性差的弊端。(3)利用本专利技术的方法、在本专利技术规定的培养基及培养条件下，诱导小麦丛生芽效率高，不定芽增殖系数最高达11.0，不定芽增殖系数平均达6.3，且技术路线稳定可行。(4)本专利技术建立的小麦高效的丛生芽诱导体系，将为小麦分子育种中的遗传转化找到新的、高效的、大众化应用的技术方法和途径，大幅度提高小麦遗传转化效率及遗传转化方法大众化的应用。附图说明图1为小偃22号品种成熟胚不定芽生长情况；图2为西北1376品种成熟胚不定芽生长情况；图3为西北183品系成熟胚不定芽生长情况。以下结合附图进一步对本专利技术做详细介绍。具体实施方式本专利技术探索了一种新的、高效地利用小麦成熟胚萌发芽体为材料，诱导小麦丛生芽的方法，将为小麦分子育种中的遗传转化找到新的、高效的、大众化应用的技术方法和途径，大幅度提高小麦遗传转化效率及遗传转化方法大众化的应用。本专利技术的各个步骤所用培养基(培养基Ⅰ、培养基Ⅱ、培养基Ⅲ、培养基IV)及各步骤的培养条件(培养温度、光照强度、培养基的pH值、用于诱导不定芽的小麦成熟胚萌发芽体的大小、用于不定芽发育的丛生芽中不定芽的大小)，是专利技术人经长期的摸索研究才得出的结果，均与本专利技术方法能否得到稳定、高效、发育健壮的不定芽有密切联系，在使用本方法时，需严格按照本方法的技术方案进行。本专利技术的MB5基本培养基为通用的培养基，即由通用基本培养基MS的大量、微量元素+通用基本培养基B5的有机物质构成。可自行配制，配方为：硝酸钾(KNO3)：1900mg/L，硝酸氨(NH4NO3)：1650mg/L，氯化钙(CaCl2·2H2O)：440mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)：370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)：170mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)：27.8mg/L，乙二酸四乙钠(Na2EDTA)：37.3mg/L，硫酸锰(MnSO4·4H2O)：22.3mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：8.6mg/L，硼酸(H3BO3)：6.2mg/L，碘化钾(KI)：0.83mg/L，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.025mg/L，氯化钴(CoCl2·6H2O)：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：10.0mg/L，盐酸吡哆锌：1.0mg/L，烟酸：1.0mg/L。实施例1：如图1所示，以普通小麦小偃22品种2015年收获半年的小麦种子为材料，本实施例提供一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法，具体步骤如下：步骤一、剥离小麦品种小偃2成熟胚接种到培养基Ⅰ上诱导小麦成熟胚萌发芽选取收获半年、籽粒饱满的小偃22种子，用无菌水冲洗2次，在无菌条件下，用质量分数为70％酒精消毒1min，0.1％升汞浸泡种子15min，无菌水冲洗4次后侵于25℃温水过夜，待小偃22种子完全吸胀后，取出种子用70％乙醇漂洗30秒后，用0.1％HgCl2消毒10min，无菌水洗4次，于无菌条件下剥取小偃22种子成熟胚接种于培养基Ⅰ中。培养基Ⅰ为MB5基本培养基附加质量浓度为4mg/LTDZ(噻二唑苯基脲)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，剥离小麦成熟胚接种到培养基Ⅰ上诱导小麦成熟胚萌发芽体；步骤二，将小麦成熟胚萌发芽置于培养基Ⅱ上诱导不定芽产生；步骤三，将步骤二得到的不定芽整丛转接于培养基Ⅲ上促进不定芽的生长发育；步骤四，从步骤三经培养基Ⅲ培养生长后的不定芽丛中，取单个不定芽置于培养基IV中壮苗生根得到小麦完整小苗；所述培养基Ⅰ为向1L MB5基本培养基中添加4mg噻二唑苯基脲、30g蔗糖和6.5g琼脂；所述培养基Ⅱ为向1L MB5基本培养基中加入1mg噻二唑苯基脲、1mg6—苄基氨基嘌呤、2mg 6—呋喃基氨基嘌呤、0.1mg 2,4—二氯苯氧乙酸、0.5mg吲哚乙酸、30g蔗糖、6.5g琼脂、300mg水解酪蛋白、250mg天门冬酰胺和200mg谷氨酰胺；所述培养基Ⅲ为向1L MB5基本培养基中加入1mg噻二唑苯基脲、0.5mg吲哚乙酸、30g蔗糖、6.5g琼脂、300mg水解酪蛋白、250mg天门冬酰胺和200mg谷氨酰胺；所述培养基IV为向1L 1/2MB5基本培养基中加入0.5mg吲哚乙酸、25g蔗糖和6.5g琼脂。

【技术特征摘要】
1.一种利用小麦成熟胚萌发芽体诱导小麦丛生芽的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，剥离小麦成熟胚接种到培养基Ⅰ上诱导小麦成熟胚萌发芽体；步骤二，将小麦成熟胚萌发芽置于培养基Ⅱ上诱导不定芽产生；步骤三，将步骤二得到的不定芽整丛转接于培养基Ⅲ上促进不定芽的生长发育；步骤四，从步骤三经培养基Ⅲ培养生长后的不定芽丛中，取单个不定芽置于培养基IV中壮苗生根得到小麦完整小苗；所述培养基Ⅰ为向1LMB5基本培养基中添加4mg噻二唑苯基脲、30g蔗糖和6.5g琼脂；所述培养基Ⅱ为向1LMB5基本培养基中加入1mg噻二唑苯基脲、1mg6—苄基氨基嘌呤、2mg6—呋喃基氨基嘌呤、0.1mg2,4—二氯苯氧乙酸、0.5mg吲哚乙酸、30g蔗糖、6.5g琼脂、300mg水解酪蛋白、250mg天门冬酰胺和200mg谷氨酰胺；所述培养基Ⅲ为向1LMB5基本培养基中加入1mg噻二唑苯基脲、0.5mg吲哚乙酸、30g蔗糖、6.5g琼脂、300mg水解酪蛋白、250mg天...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈耀锋，张月琴，权军利，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61