本发明专利技术涉及一种嗜水气单胞菌耐药基因的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：1)提取菌株中的质粒；2)质粒DNA PCR反应。PCR反应的引物对分别如SEQ ID NO：1～4所示。其优点表现在：本发明专利技术的方法是一种用鱼嗜水气单胞菌耐药基因的常规PCR检测方法，此方法快捷，灵敏，准确度高，为生产实践以及实验中检测耐药基因的检测提供更准确、灵敏的方法。
Method for detecting drug-resistant gene of Aeromonas hydrophila
The present invention relates to a method for detecting Aeromonas hydrophila resistant gene, the detection method comprises the following steps: 1) plasmid strains of plasmid DNA; 2) PCR reaction. The reaction of PCR primers respectively as SEQ ID NO:1 ~ 4 shows. Its advantages are: the method of the invention is a method of detection of conventional PCR fish Aeromonas hydrophila resistant gene, this method is fast, sensitive, accurate, method for the production practice and the detection of resistance genes to provide more accurate and sensitive.
【技术实现步骤摘要】
一种嗜水气单胞菌耐药基因的检测方法
本专利技术涉及
，具体地说，是一种嗜水气单胞菌耐药基因的检测方法。
技术介绍
嗜水气单胞菌为革兰氏阴性短杆菌，是一种条件性致病菌，广泛分布于自然界中，不仅能够给水产养殖动物带来严重的危害，导致淡水养殖鱼类大面积爆发出血性败血症和溃疡性感染，同时能引起人类肠道感染以及败血症等。嗜水气单胞菌较其他革兰氏阴性菌引起的败血症的死亡率高。临床上常用一些抗生素等抗菌类药物来预防和治疗由气单胞菌引起的疾病。近年来关于抗菌类药物的盲目以及过度使用导致气单胞菌耐药性急剧上升的案例被大量报道。四环素、磺胺类、氨基糖苷类及喹诺酮类等都存在一定程度的耐药性。由于质粒的水平转移是喹诺酮类药物的耐药性在临床上传播的主要途径，通常质粒介导的喹诺酮类药物那药性表现为敏感性细菌，很难用表型检测，常常被忽视，而逐步积累或偶联协同其他机制，奠定了多重耐药的高水平的耐药机制的基础。所以，我们有必要采取PCR或杂交等分子生物学手段，对临床上的菌株、医院附近或者养殖场等常用喹诺酮类抗菌药物的地方进行监控或者实时普查，通过质粒接合转移实验研究及时发现新型的喹诺酮耐药基因或者机制，开发新型药物来破坏或消除喹诺酮类药物耐药相关的qnr蛋白，以免耐药性的传播或扩散，防止产生喹诺酮类药物的高耐受型细菌。因此建立一种特异、快捷、灵敏常规PCR检测耐药质控基因的检测方法是非常有必要的。在中国专利申请CN201480055468.9，申请日期：2014-10-07，用于扩增细菌DNA的PCR中使用的引物组、用于检出及/或鉴定细菌菌种的试剂盒及检出及/或鉴定细菌菌种的方法的专利中，使用了其的用于PCR的试剂盒及检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的方法，以及通过使细菌来源的核酸的混入量为最小限度、并进行使用了上述的引物组的PCR法，从而达成检出或鉴定被检样品中的细菌菌种的方法的灵敏度的进一步的提高。中国专利申请CN201610840288.2，申请日期：2016-09-21，一种同步检测五种动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法，以待检样品的总DNA为模板，利用引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV和引物对V组成的多重PCR引物体系进行多重PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；其中，所述样品总DNA模板为牛、猪、羊、鸡、鸭物种肉产品中的一种或多种。利用此专利技术检测牛猪羊鸡鸭肉制品的真伪及是否有掺假，检测快速、特异性高、灵敏度高，能大大提高检测效率，节约时间，而且节省检测成本，特别适用于牛猪羊鸡鸭制品的快速防伪鉴定。此外，本专利技术的多重PCR引物体系配合相关试剂可制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能。本专利将提供一种用鱼嗜水气单胞菌耐药基因的常规PCR检测方法，此方法快捷，灵敏，准确度高，为生产实践以及实验中检测耐药基因的检测提供更准确、灵敏的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测嗜水气单胞菌耐药基因的引物对。本专利技术的再一的目的是，提供一种嗜水气单胞菌耐药基因的检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种用于检测嗜水气单胞菌耐药基因的引物对，所述的引物对的上游引物如SEQIDNO:1所示；所述的引物对的下游引物如SEQIDNO:2所示。所述的引物对的上游引物如SEQIDNO:3所示；所述的引物对的下游引物如SEQIDNO:4所示。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种嗜水气单胞菌耐药基因的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：1)提取菌株中的质粒；2)质粒DNAPCR反应。步骤1)提取菌株中的质粒的方法为：在含抗生素的培养基中接种目标菌株摇床培养，取菌液于试管，离心收集菌体，倒进培养基；在菌体沉淀中加入bufferP1，吹打均匀使菌体彻底悬浮；加入bufferP2，立即温和颠倒离心管混匀，静置；加入bufferP3，立即温和颠倒离心管充分混匀；于离心机中离心，将上清液全部移入吸附柱；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入去蛋白液bufferDW1，离心，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；向吸附柱中加入WashSolution，离心，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复上一步骤；将空的吸附柱和收集管离心；最后，在吸附膜中央加入ElutionBuffer，室温静置，离心。步骤2)中的PCR反应的上游引物如SEQIDNO:1所示；所述的引物对的下游引物如SEQIDNO:2所示。步骤2)中的PCR反应的上游引物如SEQIDNO:1所示；所述的引物对的下游引物如SEQIDNO:2所示。步骤2)的PCR反应体系：ReactionComponent单位μL2×GCBuffer112.5F(10μM)0.5R(10μM)0.5dNTP(10mM)0.2ddH2O10.1Template1Taq酶0.2Total25步骤2)的PCR反应条件：程序温度时间预变性95℃3min变性94℃30s退火55℃60s延伸72℃45s修复延伸72℃7min步骤2)：取2μLPCR产物与2μL6×LoadingBuffer、1μL10000×核酸染料混合，加入2％(W/V)的琼脂糖凝胶上进行电泳，同时以1000bp的DNAmarker作为对照，120V电压下电泳25min，在投射紫外灯下观察、照像。本专利技术优点在于：1、本专利技术的方法是一种用鱼嗜水气单胞菌耐药基因的常规PCR检测方法，此方法快捷，灵敏，准确度高，为生产实践以及实验中检测耐药基因的检测提供更准确、灵敏的方法。2、本专利技术选用了合适的引物对、合适的PCR反应条件。3、本专利技术采用了合适的质粒DNA提取方法。附图说明附图1是嗜水气单胞菌qnrS耐药基因PCR检测的电泳图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。1材料与方法1.1材料：质粒提取小试剂盒以及2×GCBuffer1、dNTP(10mM)、ddH2O、Taq酶、引物(由上海生工公司提供及合成)。1.2方法1.2.1质粒提取提取菌株中的质粒在含适当抗生素的培养基中接种目标菌株37℃摇床培养16h，取2mL菌液于试管，8000×g离心2min收集菌体，倒进培养基。在菌体沉淀中加入250μL的bufferP1，吹打均匀使菌体彻底悬浮。加入250μL的bufferP2，立即温和颠倒离心管5次混匀，静置2min。加入350μLbufferP3，立即温和颠倒离心管5次充分混匀。于离心机中12000×g离心10min，将上清液全部移入吸附柱，9000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入500μL去蛋白液bufferDW1，9000×g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。向吸附柱中加入500μLWashSolution，9000×g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复上一步骤。将空的吸附柱和收集管离心1min。最后，在吸附膜中央加入50μLElutionBuffer，室温静置2min，9000×g离心1min。将所得的质粒DNA溶液置于-20℃保存备用。1.2.2质粒DNAPCR检测体系：利用上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测嗜水气单胞菌耐药基因的引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物如SEQ ID NO:1所示；所述的引物对的下游引物如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测嗜水气单胞菌耐药基因的引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物如SEQIDNO:1所示；所述的引物对的下游引物如SEQIDNO:2所示。2.一种用于检测嗜水气单胞菌耐药基因的引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物如SEQIDNO:3所示；所述的引物对的下游引物如SEQIDNO:4所示。3.一种嗜水气单胞菌耐药基因的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：1)提取菌株中的质粒；2)质粒DNAPCR反应。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤1)提取菌株中的质粒的方法为：在含抗生素的培养基中接种目标菌株摇床培养，取菌液于试管，离心收集菌体，倒进培养基；在菌体沉淀中加入bufferP1，吹打均匀使菌体彻底悬浮；加入bufferP2，立即温和颠倒离心管混匀，静置；加入bufferP3，立即温和颠倒离心管充分混匀；于离心机中离心，将上清液全部移入吸附柱；倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，在吸附柱中加入去蛋白液bufferDW1，离心，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；...
【专利技术属性】
技术研发人员：董亚萍，胡鲲，苏惠冰，杨先乐，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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