一种超声调整固定化蛋白酶水解产物分子量分布的方法技术

本发明专利技术公开了一种超声调整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白产物分子量分布的方法，属于生物工程技术领域，其步骤如下：(1)将采用海藻酸钠或与壳聚糖混合包埋制备的固定化木瓜蛋白酶放入一个盛有大豆分离蛋白溶液的酶解反应罐；(2)步骤(1)中所述反应罐置于一个下部设有超声波发生器的超声辅助酶解槽中；(3)步骤(2)所述超声辅助酶解槽的温度通过与恒温水浴中水的不断循环得以保持恒温，并进行酶解。本发明专利技术的方法可以根据期望的蛋白质水解物分子量分布，有针对性地选择适当频率的超声波、超声功率和处理时间，为多肽的工业化生产提供了新的途径。

Method for adjusting molecular weight distribution of immobilized protease hydrolysate by ultrasonic

The invention discloses an ultrasonic adjustment method of immobilized papain hydrolysis of soybean protein molecular weight distribution, which belongs to the technical field of biological engineering, the steps are as follows: (1) using alginate or with immobilized papain chitosan mixed embedding preparation is put into a reaction tank containing soy protein solution the enzyme solution; (2) step (1) ultrasound assisted enzyme in the reaction tank, an ultrasonic generator is arranged at the lower part of the solution tank; (3) step (2) of the ultrasound assisted enzymatic hydrolysis tank temperature through continuous cycle with constant temperature water bath water to maintain a constant temperature, and enzymatic hydrolysis. The method of the invention can be distributed according to the desired amount of protein hydrolysate molecule, the ultrasonic, ultrasonic power and treatment time to select the appropriate frequency, provides a new way for the industrial production of polypeptides.

【技术实现步骤摘要】
一种超声调整固定化蛋白酶水解产物分子量分布的方法
本专利技术涉及制备蛋白酶水解产物的方法，特别涉及一种利用超声调整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白产物分子量分布的方法，属于生物工程

技术介绍
现代生物代谢研究发现：人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后，不像以前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以肽的形式直接吸收，而且，二肽和三肽的吸收速度比相同组成的氨基酸还要快。肽(peptide)是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，它也是蛋白质水解的中间产物。一般，根据肽中氨基酸的数量的不同，肽有多种不同的称呼：由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽等。通常由10～100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，它们的分子量低于10，000Da(Dalton，道尔顿)，能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。也有文献把由2～10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)，分子质量小于6000Da，能够直接参与消化、代谢及内分泌的调节，其吸收机制优于蛋白质和氨基酸。10～50个氨基酸组成的肽称为多肽。多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。多肽的种类：1、细胞因子模拟肽：利用已知细胞因子的受体从肽库内筛选细胞因子模拟肽，近年成为国内外研究的热点。国外已筛选到了人促红细胞生成素，人促血小板生成素，人生长激素、人神经生长因子及白细胞介素等多种生长因子的模拟肽，这些模拟肽的氨基酸序列与其相应的细胞因子的氨基酸序列不同，但具有细胞因子的活性，并且具有分子量小的优点。细胞因子模拟肽处于临床前或临床研究阶段。2、抗菌性活性肽：当昆虫受到外界环境刺激时产生大量的具有抗菌活性的阳离子多肽，已筛选出百余种抗菌肽，体内外实验证实，多个抗菌肽不仅有很强的杀菌能力还能杀死肿瘤细胞。例如，从蚕体内筛选的抗菌肽D表现了很好的应用前景，并能利用基因工程技术生产。蛇毒内也存在多种活性多肽，从蛇毒内分离出一个13个氨基酸(INKAIAALAKKLL)小肽，其对G+及G-菌均有极强的杀菌能力。3、用于心血管疾病的多肽：很多植物中药有降血压、降血脂、溶血栓等作用，不仅可用作药物，亦可用作保健食品。现已发现很多有效成分是小分子多肽，比如我国科学家以大豆为原料加工分离出的活性多肽，可通过小肠直接吸收，能防治血栓，高血压和高血脂，还能延缓变老，提高肌体抗肿瘤力。从人参、茶叶、银杏叶等植物内也分离出很多用于心血管疾病的小肽。4、其它药用小肽：小肽药物除在上述几大方面已取得较大进展外，在其它很多领域也取得一些进展。比如stiernberg等发现一个合成肽(TP508)能促进伤口血管的再生，加速皮肤深度伤口的愈合。Pfister等发现一个小肽(RTR)4能防止碱损伤角膜内炎症细胞的侵润，抑制炎症反应。Carron等证实其筛选的2个合成肽能抑制破骨细胞对骨质的重吸收。5、诊断用多肽：多肽在诊断试剂中最主要的用途是用作抗原检测病毒、细胞、支原体、螺旋体等微生物和囊虫、锥虫等寄生虫的抗体，多肽抗原比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强，且易于制备，因此装配的检测试剂，其检测抗体的假阴性率和本底反应都很低，易于临床应用。现在用多肽抗原装配的抗体检测试剂包括：甲、乙、丙、庚或肝病毒、艾滋病病毒、人巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、梅毒螺旋体、囊虫、锥虫、莱姆病及类风湿等。使用的多肽抗原大部分是从相应致病体的天然蛋白内分析筛选获得，有些是从肽库内筛选的全新小肽。一些多肽是源于蛋白质的多功能化合物，是多样化且来源充足的食品原料，具有多种人体代谢和生理调节功能，如易消化吸收、促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等。多数生物活性肽是以非活性状态存在于蛋白质的长链中，当用适当的蛋白酶水解时，其分子片段与活性被释放出来。蛋白酶水解产物分子量的分布与水解进程有关，受酶的种类及酶解程序等影响。邹险峰等(食品科技，2011，36(4)：9-15)研究发现在20g/L的底物浓度下的最佳条件为酶和底物比10000U/g，温度55℃，pH7.5，水解时间4h，β-伴大豆球蛋白水解肽主要为130～1000u的短肽，占肽总量的86.3％。马井喜登(中国酿造，2012，31(14)：135～141)研究在4％大豆分离蛋白，Alcalase酶与底物比值为700u/g，60℃、pH9中水解3h，发现大豆蛋白的水解物分布不集中，水解物各成分分子量相差很大，可以通过延长水解时间可以增加小肽的数量。张炎研究(大豆蛋白ACE抑制肽的酶法制备及分离纯化，安徽：合肥工业大学，2007)发现，经过60℃热处理10min后，木瓜蛋白酶用量150000u/g、40℃、pH8、大豆分离蛋白浓度3％，水解4h后，分子量分布为小于1000D、1000～3000D、3000～10000D、大于10000D分别为47.3％、9.47％、6.35％、4.32％。吴建中(大豆蛋白的酶法水解及产物抗氧化活性的研究，广州：华南理工大学，2003)研究发现：经过85℃、20min预处理后，在大豆蛋白浓度4.5～8％、50℃、pH7、木瓜蛋白酶用量8000u/g、水解150～200min后，平均肽链长度为16。陈亚房(大豆低聚肽制备及其ACE抑制活性和螯合特性的研究，北京：中国农业科学研究院，2009)研究发现：采用煮沸10min的预处理后，大豆蛋白溶液浓度5g/100ml、60℃、pH7.5、木瓜蛋白酶用量35000u/g、水解3h后，酶解产物集中在分子量1000D。CN1085046A公开了一种燕窝的酶法水解加工方法，其基本工艺是采用多种植物蛋白酶、细菌蛋白酶或试剂型蛋白酶，或者采用两种或两种以上的复合酶，原料经浸泡、煮沸、调pH值、加酶水解、再煮沸、过滤、离心、干燥等工艺，制成含水量低于5％的白色或黄色的水溶性燕窝粉末。该工艺过程工艺较为复杂，生产周期长，并涉及到高温煮沸过程，易对燕窝中的热不稳定性活性成分造成影响，并未涉及到工艺对分子量分布影响的控制。CN1057674A公开了一种燕窝、白扁豆水不溶物的生化提取方法，其工艺是将经水煮沸提取后的燕窝渣、白扁豆渣加水用木瓜酶进行酶解，将水解后的滤液和水煮提取液合并得燕窝提取物。该工艺虽然工艺得到一定简化，但也直接涉及到水煮工艺，未考虑水煮条件对热不稳定性成分活性的影响，未提到工艺和分子量分布间的关系。CN1858225A公开了一种燕窝多肽的制备方法和用途，其基本工艺为燕窝原料经冷冻粉碎、无花果蛋白酶水解、沉淀过滤、冷冻干燥或喷物干燥后得到分子量分布在200～1000D之间的燕窝多肽提取物。虽然该工艺提到了对分子量分布的要求，但得到的燕窝多肽提取物多数为1000D以下的肽类，对于1000D～6000D之间的分子量控制工艺并未提及，也未提到工艺条件和分子量分布之间的关系。2007年12月12日公开的、专利号为CN200710069423.9、名称为一种化妆品用燕窝提取物的制备工艺的中国专利技术专利公开了一种化妆品用燕窝提取物的制备工艺，步骤如下：1)燕窝冷冻粉碎过筛，加入燕窝干重20倍量的水，室温下超声水提1小时，过滤；2)滤饼中加入燕窝干重30倍量的水，机械搅拌条件下煮沸60分钟；3)冷却至室温，碳酸钠溶液调pH值至9.8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超声调整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白产物分子量分布的方法，其步骤如下：(1)将采用海藻酸钠或与壳聚糖混合包埋制备的固定化木瓜蛋白酶放入一个盛有大豆分离蛋白溶液的反应罐中；(2)步骤(1)中所述反应罐置于一个下部设有超声波发生器的超声辅助酶解槽中；(3)步骤(2)所述超声辅助酶解槽的温度通过与恒温水浴中水的不断循环得以保持恒温，并进行酶解。

【技术特征摘要】
1.一种超声调整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白产物分子量分布的方法，其步骤如下：(1)将采用海藻酸钠或与壳聚糖混合包埋制备的固定化木瓜蛋白酶放入一个盛有大豆分离蛋白溶液的反应罐中；(2)步骤(1)中所述反应罐置于一个下部设有超声波发生器的超声辅助酶解槽中；(3)步骤(2)所述超声辅助酶解槽的温度通过与恒温水浴中水的不断循环得以保持恒温，并进行酶解。2.根据权利要求1所述的超声调整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白产物分子量分布的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述超声波发生器的频率范围为28～135kHz。3.根据权利要求2所述的超声调整固定化木瓜蛋白酶水解大豆蛋白产物分子量分布的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述超声波发生器的超声功率范围为0.05～0.5W/cm2。4.根据权利要求3所述的超...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹雁平，朱雨辰，王少甲，袁英髦，许朵霞，王蓓，肖俊松，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京,11