一种利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法，包括以下步骤：采用海藻酸钠与活性炭固定化汉逊德巴利酵母；采用聚乙烯醇与海藻酸钠二次固定化汉逊德巴利酵母；将二次固定化后汉逊德巴利酵母置于发酵培养基中培养。本发明专利技术制备方法新颖、简便，操作程序易于控制，产量高，客服了传统菌种产3‑羟基丙酸产量低的缺点。

A method of using two immobilized yeast Debaryomyces polymorpha composite

The invention discloses a method for using two immobilized yeast Debaryomyces polymorpha composite material, which comprises the following steps: using sodium alginate and activated carbon immobilized Debaryomyces Hansenula yeast; polyvinyl alcohol and sodium alginate immobilized yeast Hansenula Debali two times; two times of immobilized yeast fermentation in Hanson de Barry medium. The preparation method of the invention is novel and simple operation procedure, easy control, high yield, has overcome the traditional producing strain of 3 yield low hydroxy propionic acid.

【技术实现步骤摘要】
一种利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法
本专利技术涉及一种固定化汉逊德巴利酵母的方法，具体涉及一种利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法。
技术介绍
3-羟基丙酸在工业上主要作为化学中间体，可以合成乙烯基氰、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、1，3-丙二醇和丙二酸等，它还是新型绿色环保材料聚3-羟基丙酸的重要原料。除此之外，3-羟基丙酸在生产特殊涂料、金属润滑剂、纺织业上的抗静电剂及食品、饲料添加剂和保鲜剂等行业都有广泛应用。目前化学方法生产3-羟基丙酸由于对环境污染危害较大，已经逐步被生物合成法所替代。然而生物合成法生产3-羟基丙酸普遍存在产量低的弊端，导致供需之间的不平衡。细胞固定化技术是通过化学或者物理的方法将细胞或者细胞产生的游离酶固定在与之对应载体上，用以催化细胞增殖及生化反应的技术。固定化细胞技术具有良好的稳定性能、简单方便的操作、产物易于分离、生产效率高、可以实现连续化生产等优势。但是固定化细胞技术还有很多问题有待解决，比如固定化方式、寻找耐受性强的包埋材料、提高产物产量等。目前利用固定化细胞制备3-羟基丙酸需要解决的主要问题是如何提高产量与载体的稳定性。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法，固定化后载体稳定，并且提高了3-羟基丙酸的产量，适合产业化推广。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法，包括以下步骤：S1、将汉逊德巴利酵母依次经种子斜面培养基活化、发酵培养基培养后，通过无菌纱布过滤分离汉逊德巴利酵母液体发酵菌种和发酵培养基，得汉逊德巴利酵母液体发酵菌种液；S2、将海藻酸钠、活性炭的混合物与所得的汉逊德巴利酵母液体发酵菌种与按照0.5∶1-1∶1(w/v)比例混合，得混合液；其中，海藻酸钠终浓度为25-35g/L，活性炭终浓度为8-10g/L；S3、用注射器吸取混合液滴入浓度为19-21g/L的CaCl2溶液内，，室温固定1-3h，得直径0.3-0.5cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；S4、按照2-3个小球/mg过滤后的菌种的标准，将步骤S3所得的汉逊德巴利酵母小球与过滤分离后的上述S1步骤的液体发酵菌种混合，再加入聚乙烯醇和海藻酸钠并混匀，聚乙烯醇终浓度为80-100g/L，海藻酸钠终浓度在9-11g/L；用直径0.8cm吸管吸取混合液滴入浓度为9-11g/L的CaCl2溶液内，室温固定1-3h，4℃冰箱固定1-3h，得直径0.8-1.2cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；S5、将步骤S4所得的汉逊德巴利酵母小球加入到80-120ml液体发酵培养基/250ml锥形瓶培养，28-32℃，在转速为220-280r/min的恒温振荡箱中培养48-72h。优选地，第一次固定化后汉逊德巴利酵母小球直径为0.3cm，第二次固定化后汉逊德巴利酵母小球直径为1.2cm。优选地，所述步骤S2中海藻酸钠、活性炭混合物中海藻酸钠溶液/活性炭＝1∶1(w/v)。优选地，所述步骤S4中聚乙烯醇、海藻酸钠混合物中聚乙烯醇/海藻酸钠溶液＝2∶1(w/v)。优选地，第一次固定化所用海藻酸钠终浓度为30g/L，第二次固定化所用海藻酸钠终浓度为10g/L。优选地，第一次固定化所用CaCl2溶液的浓度为21g/L，第二次固定化所用CaCl2终浓度为10g/L。优选地，第一次固定化所用活性炭终浓度为8g/L，第二次固定化所用聚乙烯醇终浓度为90g/L。本专利技术具有以下有益效果：利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法，制备方法新颖、简便，操作程序易于控制，产量高，克服了传统菌种产3-羟基丙酸产量低的缺点，，固定化后载体稳定，并且提高了3-羟基丙酸的产量，适合产业化推广。附图说明图1为本专利技术实施例中3-羟基丙酸标准样品高效液相色谱图；图2为未固定化汉逊德巴利酵母产3-羟基丙酸高效液相色谱图；图3为本专利技术实施例所得的复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母产3-羟基丙酸高效液相色谱图。具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。以下实施例中，所使用的汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)：本实验室从葡萄表面分离后，于2015年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNo.11893。种子斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母浸膏6，玉米浆9，(NH4)2SO415，KH2PO49，K2HPO43，MgSO41.46，FeSO4·7H2O0.03，琼脂20，自然pH；种子培养基(g/L)：甘油20，酵母浸膏6，麦芽汁9，(NH4)2SO415，KH2PO43、MgSO41.46，FeSO4·7H2O0.03，自然pH；发酵培养基(g/L)：在种子培养基的基础上，按2％(v/v)加入丙酸。实施例1(1)海藻酸钠与活性炭固定化汉逊德巴利酵母采用种子斜面培养基活化汉逊德巴利酵母，经种子培养基和发酵培养基培养后获得汉逊德巴利酵母液体发酵菌种，无菌纱布过滤分离汉逊德巴利酵母细胞和发酵培养基，按照0.5∶1(w/v)比例，将汉逊德巴利酵母液体发酵菌种与海藻酸钠、活性炭混合，海藻酸钠终浓度为25g/L，活性炭终浓度为8g/L；用注射器吸取混合液滴入CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为19g/L，室温固定1h，制备成直径0.3cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；(2)聚乙烯醇与海藻酸钠二次固定化汉逊德巴利酵母按照2个/mg的标准，将第一次固定化汉逊德巴利酵母小球再次与过滤分离后的液体发酵菌种混合，聚乙烯醇终浓度为80g/L，海藻酸钠终浓度在9g/L；用直径0.8cm吸管吸取混合液滴入CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为9g/L，室温固定1h，4℃冰箱固定1h，制备成直径0.8cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；(3)高效液相色谱测定3-羟基丙酸含量将第二次固定化汉逊德巴利酵母小球加入到80ml液体发酵培养基/250ml锥形瓶培养，温度为28℃，在转速为220r/min的恒温振荡箱中培养48h，利用高效液相色谱测定每次过滤分离的发酵培养基中3-羟基丙酸含量，取3次平均值为22.56g/L。实施例2(1)海藻酸钠与活性炭固定化汉逊德巴利酵母采用种子斜面培养基活化汉逊德巴利酵母，经种子培养基和发酵培养基培养后获得汉逊德巴利酵母液体发酵菌种，无菌纱布过滤分离汉逊德巴利酵母细胞和发酵培养基，按照1∶1(w/v)比例，将汉逊德巴利酵母液体发酵菌种与海藻酸钠、活性炭混合，海藻酸钠终浓度为30g/L，活性炭终浓度为9g/L；用注射器吸取混合液滴入CaCl2溶液，所述CaCl2溶液的浓度为20g/L，室温固定2h，制备成直径0.4cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；(2)聚乙烯醇与海藻酸钠二次固定化汉逊德巴利酵母按照3个/mg的标准，将第一次固定化汉逊德巴利酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将汉逊德巴利酵母依次经种子斜面培养基活化、发酵培养基培养后，通过无菌纱布过滤分离汉逊德巴利酵母液体发酵菌种和发酵培养基，得汉逊德巴利酵母液体发酵菌种液；S2、将海藻酸钠、活性炭的混合物与所得的汉逊德巴利酵母液体发酵菌种与按照0.5∶1‑1∶1(w/v)比例混合，得混合液；其中，海藻酸钠终浓度为25‑35g/L，活性炭终浓度为8‑10g/L；S3、用注射器吸取混合液滴入浓度为19‑21g/L的CaCl2溶液内，室温固定1‑3h，得直径0.3‑0.5cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；S4、按照2‑3个小球/mg过滤后的菌种的标准，将步骤S3所得的汉逊德巴利酵母小球与过滤分离后的上述S1步骤的液体发酵菌种混合，再加入聚乙烯醇和海藻酸钠并混匀，聚乙烯醇终浓度为80‑100g/L，海藻酸钠终浓度在9‑11g/L；用直径0.8cm吸管吸取混合液滴入浓度为9‑11g/L的CaCl2溶液内，室温固定1‑3h，4℃冰箱固定1‑3h，得直径0.8‑1.2cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；S5、将步骤S4所得的汉逊德巴利酵母小球加入到80‑120ml液体发酵培养基/250ml锥形瓶培养，28‑32℃，在转速为220‑280r/min的恒温振荡箱中培养48‑72h。...

【技术特征摘要】
1.一种利用复合材料二次固定化汉逊德巴利酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将汉逊德巴利酵母依次经种子斜面培养基活化、发酵培养基培养后，通过无菌纱布过滤分离汉逊德巴利酵母液体发酵菌种和发酵培养基，得汉逊德巴利酵母液体发酵菌种液；S2、将海藻酸钠、活性炭的混合物与所得的汉逊德巴利酵母液体发酵菌种与按照0.5∶1-1∶1(w/v)比例混合，得混合液；其中，海藻酸钠终浓度为25-35g/L，活性炭终浓度为8-10g/L；S3、用注射器吸取混合液滴入浓度为19-21g/L的CaCl2溶液内，室温固定1-3h，得直径0.3-0.5cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；S4、按照2-3个小球/mg过滤后的菌种的标准，将步骤S3所得的汉逊德巴利酵母小球与过滤分离后的上述S1步骤的液体发酵菌种混合，再加入聚乙烯醇和海藻酸钠并混匀，聚乙烯醇终浓度为80-100g/L，海藻酸钠终浓度在9-11g/L；用直径0.8cm吸管吸取混合液滴入浓度为9-11g/L的CaCl2溶液内，室温固定1-3h，4℃冰箱固定1-3h，得直径0.8-1.2cm的固定化汉逊德巴利酵母小球，无菌纱布过滤分离小球后无菌水清洗2次；S5、将步骤S4所得的汉逊德巴利酵母小球加入到80-120ml液体发酵培养基/2...

【专利技术属性】
技术研发人员：董玉玮，高明侠，王陶，张传丽，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32