胶孢炭疽菌中分离的化合物及其制备方法与用途技术

本发明专利技术公开了一种胶孢炭疽菌中分离的化合物及其制备方法与用途，所述胶孢炭疽菌中分离的化合物的分子式为：C15H22O3，所述化合物的制备方法为：取已冻存好的胶孢炭疽菌菌株活化，将活化的菌株接种至培养基培养，配制PDB液体培养基，灭菌；另无菌水溶解青霉素、链霉素各一瓶，加入发酵罐中；再将所述灭菌后培养物接入发酵罐中发酵；发酵结束后将所得发酵产物抽滤得菌丝体。再进行萃取、浓缩后得到菌液提取物；将粗提物进行柱层析、洗脱、湿法装柱，再次洗脱，硅胶柱层析，再用石油醚‑丙酮洗脱液进行洗脱、柱层析、氯仿‑甲醇洗脱脱色，分离得化合物胶孢炭疽菌素甲。本发明专利技术提供的化合物，可用于制备抗老年痴呆药物。

Compounds isolated from Bacillus anthracis and preparation method and use thereof

The invention discloses a separation of Colletotrichum gloeosporioides in compound and its preparation method and use molecular compound separating the Colletotrichum sp. in the: C15H22O3, preparation method of the compound is: has frozen Colletotrichum gloeosporioides strain good activation, activation of the strain inoculated to the culture medium, culture medium, preparation of PDB liquid sterilization; other sterile water dissolved penicillin and streptomycin each bottle, adding fermentation tank; and then the sterilized fermentation material access in fermentation tank; after fermentation the fermentation mycelium filtration. Then after extraction and concentration were obtained by liquid extract; crude extract by column chromatography, elution, wet packing, again elution, silica gel column chromatography, acetone and petroleum ether eluted, chloroform methanol elution chromatography, decolorization, separation of compound gum spore anthrax bacterium a. The compound provided by the invention can be used for preparing anti senile dementia medicine.

【技术实现步骤摘要】
胶孢炭疽菌中分离的化合物及其制备方法与用途
本专利技术属于药物分离制备
，尤其涉及一种胶孢炭疽菌中分离的化合物及其制备方法与用途。
技术介绍
阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)，即老年性痴呆，是一种渐进性的、神经衰退疾病，伴有记忆丧失和认知障碍等特征，随着老龄化的速度加快，阿尔茨海默病患者的人数急剧增加，并逐渐上升为一个社会问题，阿尔茨海默病的治疗也成为了科学界亟待解决的问题。如今，阿尔茨海默病的病因及发病机制尚未阐明。目前，国内外临床研究表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂是治疗AD最有效的药物，因为对乙酰胆碱酶有抑制的药物，可显著提高AD病人脑内的乙酰胆碱水平，起到预防和治疗AD的作用。乙酰胆碱酯酶(AChE)是特异性水解乙酰胆碱(ACh)的酶，主要存在于胆碱能神经元、神经肌肉接头、红细胞等组织中。因为中枢乙酰胆碱酯酶(AChE)被抑制后能够增加脑内乙酰胆碱含量，而现代病理学研究显示：脑内胆碱能神经减少，使乙酰胆碱下降是导致阿尔茨海默病(AD)的关键原因，所以临床上主要使用乙酰胆碱酯酶抑制剂来治疗阿尔茨海默病(MayeuxR,SanoM.TreatmentofAlzheimer'sdisease.Nejm.,1999,341:1670-1679.)。药用植物内生真菌是一大类刚刚起步研究的新的资源微生物，随着对药用植物内生真菌的深入研究，从药用植物内生真菌中寻找新的生物活性成分已成为各领域的研究热点，如农用药物、污水处理、石油勘探、精细化工、治疗药物、发酵及食品工程、单细胞蛋白、生物多聚物、酶制剂及人类蛋白质遗传工程等，其中医药和农用药物受到了更为特别的重视。本专利技术使用的胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)是从钩藤(Uncariatomentosa)上分离得到的一株菌株，本专利技术从胶孢炭疽菌中分离出一种化合物——胶孢炭疽菌素甲(ColletotrichineA)，并通过改良的Ellman法测定了该化合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性，测定结果表明该化合物具有较强的乙酰胆碱酯酶抑制活性，因而该化合物能作为乙酰胆碱酯酶抑制剂用于老年痴呆症药物的制备。但是，到目前为止，尚未见关于从胶孢炭疽菌中分离得到胶孢炭疽菌素甲以及其对乙酰胆碱酯酶抑制活性的报道。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术人通过大量的实验与创造性的劳动，从胶孢炭疽菌中分离得到一种新的化合物，并且惊奇的发现，这种化合物具有有效的乙酰胆碱酯酶抑制活性。本专利技术的目的在于提供一种胶孢炭疽菌中分离的化合物，所述胶孢炭疽菌中分离的化合物命名为胶孢炭疽菌素甲，分子式为：C15H22O3，结构式如下：本专利技术的另一目的在于提供胶孢炭疽菌中分离的化合物的制备方法，包括以下步骤：(1)胶孢炭疽菌的发酵a.菌株活化：取已冻存好的胶孢炭疽菌菌株，在超净工作台中接种至PDA固体培养基的平板上，28℃恒温培养箱中培养7天；b.接种及菌株的一级发酵：将活化的菌株接种至装有200mLPDB液体培养基的500ml锥形瓶中，共设12瓶，置于28℃恒温气浴旋转式摇床培养；c.菌株的大批量发酵：配制PDB液体培养基共计45L，进行灭菌，灭菌结束后冷却培养基至室温；另无菌水溶解青霉素、链霉素各一瓶，加入发酵罐中；再将菌株一级发酵培养物接入发酵罐中，保持28℃，控制通气量和保持发酵液循环，发酵21天，得菌液；(2)胶孢炭疽菌次级代谢物的提取发酵结束后将所得发酵产物抽滤，分别得到深褐色滤液和黑色菌丝体。发酵液50L用等体积的有机溶剂萃取三次，合并有机层，减压浓缩，得到菌液提取物；(3)菌液提取物次级代谢产物的分离a.将粗提物用HPD-100大孔树脂进行柱层析，配制乙醇体积含量分别为0％、10％、30％、50％、70％、90％、100％的乙醇-水洗脱液，依次进行梯度洗脱，然后弃去水洗脱部分，TLC检测跟踪合并，得到6个组分，分别记为：Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6；b.取50g的MCI-gel湿法装柱，称取2gFr.4样品湿法上样，配制乙醇与水体积比分别为0:100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0的甲醇-水洗脱液，依次进行梯度洗脱，每个梯度用5L洗脱液洗脱，每250ml收集浓缩一次，TLC检测合并得到7个粗组分，分别记为：Fr.4-A、Fr.4-B、Fr.4-C、Fr.4-D、Fr.4-E、Fr.4-F、Fr.4-G；c.选取Fr.4-B进行硅胶柱层析，所述硅胶目数为200～300目，用石油醚-丙酮洗脱液进行洗脱，TLC点板合并，再用sephdexLH-20柱层析,然后用氯仿-甲醇洗脱液进行洗脱脱色，脱色后用高效液相色谱进行分离，收集tR＝45min的峰得到胶孢炭疽菌素甲。进一步地，步骤(1)b中，所述恒温气浴旋转式摇床的转速为160r/min，培养时间为10天，发酵总体积为2.4L。进一步地，步骤(1)c中，所述灭菌是在蒸气发生装置上灭菌，灭菌温度为115-118℃，灭菌时间为2.5h。进一步地，步骤(1)c中，所述灭菌是在空气过滤器用灭菌锅上灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。进一步地，步骤(3)c中，所述石油醚-丙酮洗脱液中石油醚与丙酮的体积比为20:1，所述氯仿-甲醇洗脱液中氯仿与甲醇的体积比为1:1。进一步地，步骤(3)c中，所述高效液相色谱的流速为2ml/min，流动相为48％的甲醇，检测波长为210nm，色谱柱为Gemini-NX柱。本专利技术的又一目的在于提供胶孢炭疽菌中分离的化合物在制备抗老年痴呆药物方面的用途。本专利技术提供的胶孢炭疽菌中分离的化合物，通过测定所述化合物的乙酰胆碱酯酶活性，得到所述化合物具有有效的抗乙酰胆碱酯酶活性，是良好的天然乙酰胆碱酯酶抑制剂；并使用所述化合物对东莨菪碱诱导的痴呆大鼠学习记忆能力的影响进行了进一步研究，结果显示所述化合物能明显改善痴呆大鼠的学习记忆能力。另外，所述化合物的制备方法简单，制备条件易控，可将所述化合物与药学上可以接受的载体或其它赋型型相结合，按照常规方法制成经口服给药的内用型、非口服给药的注射剂或其它剂型，在临床上用于老年痴呆症(阿尔恣海默症)的治疗。附图说明图1是本专利技术实施例提供的胶孢炭疽菌中分离的化合物胶孢炭疽菌素甲的结构式。图2是本专利技术实施例提供的胶孢炭疽菌中分离的化合物胶孢炭疽菌素甲的IR光谱图。图3是本专利技术实施例提供的胶孢炭疽菌中分离的化合物胶孢炭疽菌素甲的1H-NMR谱图。图4是本专利技术实施例提供的胶孢炭疽菌中分离的化合物胶孢炭疽菌素甲的13C-NMR谱图。图5是本专利技术实施例提供的胶孢炭疽菌中分离的化合物胶孢炭疽菌素甲的DEPT谱图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图及具体实施例对本专利技术的应用原理作进一步描述。实施例1本专利技术的化合物的制备：(1)胶孢炭疽菌的发酵a.菌株活化：取已冻存好的胶孢炭疽菌菌株，在超净工作台中接种至PDA固体培养基的平板上，28℃恒温培养箱中培养7天；b.接种及菌株的一级发酵：将活化的菌株接种至装有200mLPDB液体培养基的500本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶孢炭疽菌中分离的化合物，其特征在于，所述化合物命名为胶孢炭疽菌素甲，分子式为：C15H22O3，结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种胶孢炭疽菌中分离的化合物，其特征在于，所述化合物命名为胶孢炭疽菌素甲，分子式为：C15H22O3，结构式如下：2.一种如权利要求1所述胶孢炭疽菌中分离的化合物的制备方法，包括以下步骤：(1)胶孢炭疽菌的发酵a.菌株活化：取已冻存好的胶孢炭疽菌菌株，在超净工作台中接种至PDA固体培养基的平板上，28℃恒温培养箱中培养7天；b.接种及菌株的一级发酵：将活化的菌株接种至装有200mLPDB液体培养基的500ml锥形瓶中，共设12瓶，置于28℃恒温气浴旋转式摇床培养；c.菌株的大批量发酵：配制PDB液体培养基共计45L，进行灭菌，灭菌结束后冷却培养基至室温；另无菌水溶解青霉素、链霉素各一瓶，加入发酵罐中；再将菌株一级发酵培养物接入发酵罐中，保持28℃，控制通气量和保持发酵液循环，发酵21天，得菌液；(2)胶孢炭疽菌次级代谢物的提取发酵结束后将所得发酵产物抽滤，分别得到深褐色滤液和黑色菌丝体；发酵液50L用等体积的有机溶剂萃取三次，合并有机层，减压浓缩，得到菌液提取物；(3)菌液提取物次级代谢产物的分离a.将粗提物用HPD-100大孔树脂进行柱层析，配制乙醇体积含量分别为0％、10％、30％、50％、70％、90％、100％的乙醇-水洗脱液，依次进行梯度洗脱，然后弃去水洗脱部分，TLC检测跟踪合并，得到6个组分，分别记为：Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6；b.取50g的MCI-gel湿法装柱，称取2gFr.4样品湿法上样，配制乙醇与水体积比分别为0:100，20:80，40:60，60:40，80:20，100:0的甲醇-水洗脱液，依次进行梯度洗脱，每个梯度用5L洗脱液洗脱，每250ml...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨中铎，陈效威，
申请(专利权)人：兰州理工大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62