一种生长抑素14肽卵黄抗体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生长抑素14肽卵黄抗体及其制备方法。所述生长抑素14肽的卵黄抗体是将羰基活化试剂与半抗原生长抑素14肽中赖氨酸侧链上的伯氨基相耦合，对血蓝蛋白KLH进行羧基活化制成免疫抗原，并用所述免疫抗原免疫母鸡，并从免疫母鸡所产鸡蛋的卵黄液中提取得到。所述生长抑素14肽卵黄抗体中IgY的纯度为87％，蛋白浓度可达到9.6mg/mL，生长抑素14肽卵黄抗体的效价为1：64000。由于生长抑素14肽卵黄抗体在特异性、稳定性和生产便利上均优于IgG，不仅可以治疗疾病还能在免疫学检测上发挥作用，也可以实现产业化，作为药物、检测试剂大规模生产，具有很大的应用前景。

Somatostatin 14 peptide yolk antibody and preparation method thereof

The invention discloses a somatostatin 14 peptide yolk antibody and a preparation method thereof. The egg yolk antibody against somatostatin peptide 14 is the carbonyl activating reagent with the hapten peptide somatostatin 14 lysine in primary amino acid side chain coupled to hemocyanin KLH carboxyl activation to produce the immune antigen, and the immunized hens, egg yolk and extracted from immunized hens the egg production. In the somatostatin 14 peptide yolk antibody, the purity of IgY is 87%, the protein concentration can reach 9.6mg/mL, and the titer of the somatostatin 14 peptide yolk antibody is 1:64000. The somatostatin peptide 14 egg yolk antibodies were superior in specificity, stability and production facilities on IgG, not only can treat diseases can also play a role in the immunological detection, also can realize the industrialization, as a drug, kit for mass production, with a great application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种生长抑素14肽卵黄抗体及其制备方法
本专利技术属于生物制药和免疫学检测领域，更具体地，涉及一种生长抑素14肽卵黄抗体及其制备方法。
技术介绍
生长抑素14肽是调节动物生长的小分子多肽。SS是通过抑制垂体生长激素，促卵泡素，促乳素等激素的分泌和抑制消化系统的蛋白酶、消化液的合成与分泌等途径起到抑制动物生长、消化和泌乳的作用。它最初是从羊和猪的下丘脑提取液中分离得到，并于20世纪70年代人工合成，是环状14肽，在Cys3和Cys14之间存在一个二硫键。制备的生长抑素14肽卵黄抗体可以作为药物，用于促进生长激素、促乳素及一些消化酶的分泌，也可以作为添加剂加入到动物饲料中，达到促进动物生长的目的，提高养殖效率。生长抑素卵黄抗体由于其优于IgG的免疫特性，可用于检测动物或人体中的多种激素水平的异常状态，并来作为诊断疾病的一种检验方式。由于生长抑素14肽作为半抗原没有免疫原性，其分子量只有1638，单独的多肽不足以激起充分的免疫反应，必须将半抗原与大分子蛋白偶联作为完全抗原才能激发抗原的免疫活性。最普遍使用的偶联载体蛋白是牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)，它们在一些免疫检测实验中作为阻断剂而限制了它们的使用，而KLH在ELISE或Westernblotting检测中没有抑制作用从而不影响实验结果。因此，在这种偶联方式制得的抗体具有更广的应用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种生长抑素14肽卵黄抗体。该生长抑素14肽卵黄抗体具有纯度高，免疫性能好以及特异性强的优点。本专利技术的另一个目的在于提供一种上述生长抑素14肽卵黄抗体的制备方法。该方法是通过碳二亚胺法，将血蓝蛋白KLH人工偶联到天然的生长抑素14肽半抗原的N端，制得的完全抗原作为免疫抗原，免疫产蛋母鸡，并从其所产蛋的蛋黄中经PEG或硫酸铵沉淀的纯化得到生长抑素14肽卵黄抗体。本专利技术的再一目的在于提供上述的生长抑素14肽卵黄抗体的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现：一种生长抑素14肽的卵黄抗体，是将羰基活化试剂与半抗原生长抑素14肽中赖氨酸侧链上的伯氨基相耦合，对血蓝蛋白KLH进行羧基活化制成免疫抗原，并用所述免疫抗原免疫母鸡，并从免疫母鸡所产鸡蛋的卵黄液中提取得到。优选地，所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。上述生长抑素14肽的卵黄抗体的制备方法，包括如下具体步骤：S1.免疫抗原的制备：(1)在pH4.5-5条件下，将血蓝蛋白KLH溶解于无水乙醇，再用蒸馏水稀释后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，在4℃下搅拌反应30～60min，得到KLH处理液；(2)将半抗原生长抑素14肽用20％的乙醇溶解后，300～500μL/秒滴入KLH处理液中，使血蓝蛋白KLH含量与半抗原生长抑素14肽的摩尔量相等，调整pH值为7.0，在4℃下反应20～24h，将产物在4℃下PBS中透析，冷冻干燥后得到血蓝蛋白KLH-生长抑素14肽；(3)用磷酸盐缓冲液溶解血蓝蛋白KLH-生长抑素14肽配成1mg/mL的溶液，制得免疫抗原，-20℃冻存备用；S2.免疫：首次免疫时将免疫抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后，采用鸡翅部多点皮下注射免疫母鸡，用免疫抗原和弗氏不完全佐剂加强免疫，首次免疫后每隔14天加强免疫一次，共加强免疫四次；S3.抗体粗品的制备：在首次免疫后的第20～80天收集鸡蛋，鸡蛋按照天数进行分批，3～4天分为一批处理，鸡蛋先用70％的酒精消毒，打破蛋壳后倾倒掉蛋清液，刺破卵黄膜，得到含有生长抑素14肽的卵黄抗体的卵黄液，即为生长抑素14肽的卵黄抗体粗品；S4.生长抑素14肽的卵黄抗体粗品经提纯处理，得到生长抑素14肽的卵黄抗体。优选地，步骤S1中(1)所述血蓝蛋白KLH与无水乙醇的质量体积比为5～6：1mg/mL，所述血蓝蛋白KLH与蒸馏水的质量体积比为1：6～10mg/mL，所述血蓝蛋白KLH和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的质量比1：1.5～2；步骤S1中(2)所述半抗原生长抑素14肽与乙醇溶液的质量体积比为1：1～2mg/mL，所述半抗原生长抑素14肽和KLH处理液的体积比1：50～80；步骤S1中(3)所述冷冻干燥的温度为-60～-80℃，冷冻干燥的时间16～20h。优选地，步骤S2中所述的免疫抗原与弗氏不完全佐剂的体积比为1：1。优选地，步骤S4中所述提纯的方法包括如下具体步骤：S11.卵黄液用PEG/PBS溶液稀释并不断搅拌，静置16～24h后用纱布过滤再离心得到上清液，加入PEG6000溶液搅拌再次沉淀，离心后的沉淀用PBS溶解再进行透析，冻干保存，所得粉体即为生长抑素14肽的卵黄抗体；或者，S21.用酸化双蒸水稀释卵黄液并不断搅拌，静置16～24h后离心得到上清液，S22.上清液用饱和硫酸铵溶液混合搅拌，离心，得到沉淀，S23.再用PBS溶液溶解步骤S22所得沉淀，加入饱和硫酸铵溶液，搅拌后离心，得到的沉淀用PBS溶解再透析，冻干保存，所得粉体即为生长抑素14肽的卵黄抗体。优选地，步骤S11中所述卵黄液与PEG/PBS溶液的体积比为1：3～4，所述PEG/PBS溶液的浓度为3％～5％，所述PEG6000溶液的浓度为10％～15％。优选地，步骤S21中所述酸化双蒸水是用盐酸调节pH＝4.7～5.6的蒸馏水。优选地，步骤S21中所述酸化双蒸水与卵黄液的体积比为6～10：1，步骤S22中所述上清液和饱和硫酸铵溶液的体积比为1：0.8～1.2，步骤S23中所述步骤S22所得沉淀与PBS溶液的质量体积比为1：10～50mg/mL。上述的生长抑素14肽卵黄抗体在制备酶联免疫试剂盒以检测生长抑素类药物疫苗中生长抑素的定性检测和动物的饲料的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1.本专利技术的生长抑素14肽的卵黄抗体的制备过程简易可实现产业化，其中采用的PEG或硫酸铵沉淀的纯化方法获得的抗体不仅纯度高，同时还保留了抗体的高效价。2.本专利技术将没有免疫原性的半抗原生长抑素14肽，与带有很多抗原表位的血蓝蛋白KLH进行偶联，有利于刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应，从而刺激动物体更易产生特异性良好且活性突出的抗体。3.本专利技术的生长抑素14肽的卵黄抗体卵黄抗体的特异性高，免疫性能好，抗体的稳定性突出，不仅可制成药物治疗或预防疾病，还可以在养殖技术上作为一种添加剂促进动物生长，同时也在生物诊断和免疫学检测上有广泛的用途。附图说明图1为实施例4中生长抑素14肽卵黄抗体的SDS-PAGE电泳图。图2为实施例5中生长抑素14肽卵黄抗体的效价。图3为实施例6中生长抑素14肽卵黄抗体的竞争抑制曲线。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。实施例中所用弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂分别采购于美国Sigma-Aldrich公司。实施例中选用的产蛋白羽鸡购于广州良田良沙养殖场。实施例1生长抑素14肽卵黄抗体的制备方法免疫抗原KLH-SS14的制备：将100mg血蓝蛋白KLH溶解于20ml无本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生长抑素14肽的卵黄抗体，其特征在于，所述生长抑素14肽的卵黄抗体是将羰基活化试剂与半抗原生长抑素14肽中赖氨酸侧链上的伯氨基相耦合，对血蓝蛋白KLH进行羧基活化制成免疫抗原，并用所述免疫抗原免疫母鸡，并从免疫母鸡所产鸡蛋的卵黄液中提取得到。

【技术特征摘要】
1.一种生长抑素14肽的卵黄抗体，其特征在于，所述生长抑素14肽的卵黄抗体是将羰基活化试剂与半抗原生长抑素14肽中赖氨酸侧链上的伯氨基相耦合，对血蓝蛋白KLH进行羧基活化制成免疫抗原，并用所述免疫抗原免疫母鸡，并从免疫母鸡所产鸡蛋的卵黄液中提取得到。2.根据权利要求1所述的生长抑素14肽卵黄抗体，其特征在于，所述羰基活化试剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐。3.根据权利要求1或2所述生长抑素14肽的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：S1.免疫抗原的制备：(1)在pH4.5-5条件下，将血蓝蛋白KLH溶解于无水乙醇，再用蒸馏水稀释后，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，在4℃下搅拌反应30～60min，得到KLH处理液；(2)将半抗原生长抑素14肽用20％的乙醇溶解后，300～500μL/秒滴入KLH处理液中，使血蓝蛋白KLH含量与半抗原生长抑素14肽的摩尔量相等，调整pH值为7.0，在4℃下反应20～24h，将产物在4℃下PBS中透析，冷冻干燥后得到血蓝蛋白KLH-生长抑素14肽；(3)用磷酸盐缓冲液溶解血蓝蛋白KLH-生长抑素14肽配成1mg/mL的溶液，制得免疫抗原，-20℃冻存备用；S2.免疫：首次免疫时将免疫抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后，采用鸡翅部多点皮下注射免疫母鸡，用免疫抗原和弗氏不完全佐剂加强免疫，首次免疫后每隔14天加强免疫一次，共加强免疫四次；S3.抗体粗品的制备：在首次免疫后的第20～80天收集鸡蛋，鸡蛋按照天数进行分批，3～4天分为一批处理，鸡蛋先用70％的酒精消毒，打破蛋壳后倾倒掉蛋清液，刺破卵黄膜，得到含有生长抑素14肽的卵黄抗体的卵黄液，即为生长抑素14肽的卵黄抗体粗品；S4.生长抑素14肽的卵黄抗体粗品经提纯处理，得到生长抑素14肽的卵黄抗体。4.根据权利要求3所述的生长抑素14肽的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1中(1)所述血蓝蛋白KLH与无水乙醇的质量体积比为5～6：1mg/mL，所述血蓝蛋白KLH与蒸馏水的质量体积比为1：6～10mg/mL，所述血蓝蛋白KLH和1-乙基-(3-二甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵肃清，梁雨昕，夏娜娜，吕瑞，王荣华，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44