一种二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒，所述试剂盒包括：流动相A、流动相B、校正品、标准品；其中流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，校正品为亮氨酸脑啡肽，标准品为甘油一酸酯和甘油磷酰乙醇胺的混合物，其中甘油一酸酯和甘油磷酰乙醇胺的体积比为18:2。本发明专利技术通过对血清样本的检测，在液相色谱—质谱联用技术的原理下，采集血清各个物质的信号，对数据分析，通过制定受试者工作特征曲线，得出联合检测MG与GONE的峰值，最后通过计算获得检测结果，本发明专利技术具有高的特异性和灵敏度，是一种客观、便捷的检测手段。

A two leaf aortic malformation screening kit

The invention discloses a two leaf aortic valve malformation screening kit, the kit includes: mobile phase A, mobile phase B, calibrator, standard; the mobile phase A was 0.1% (v/v) aqueous formic acid, mobile phase B was 0.1% (v/v) acetonitrile solution of formic acid, calibrator leucine enkephalin, standard as a mixture of glycerol ester and glyceryl phosphorylethanolamine, wherein monoglyceride and glycerophosphorylethanolamine volume ratio was 18:2. The present invention through detection of the serum samples, in liquid chromatography mass spectrometry technology principle, signal collection of serum of various substances, for data analysis, through the establishment of a receiver operating characteristic curve, the peak value of combined detection of MG and GONE, finally obtained the test results, the present invention has high the sensitivity and specificity, is an objective and convenient detection means.

【技术实现步骤摘要】
一种二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒
本专利技术涉及心脏瓣膜畸形筛查
，尤其涉及一种二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒。
技术介绍
二叶式主动脉瓣畸形(BAV)早期检测是困难的，而确定性诊断通常需要心脏超声观察心腔和心脏瓣膜。虽然心脏超声检查有非侵袭性和无辐射的优点，但超声检查是针对个人进行的检查，并且也不能自动化。不仅如此，对心脏超声结果正确的判断很大程度依赖医师的技术水平。因此目前的超声检查对人群筛查二叶式主动脉瓣畸形存在较大的不足。
技术实现思路
有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种客观、便捷的二叶式主动脉瓣畸形筛查方法及其试剂盒，从而克服现有的超声技术对二叶式主动脉瓣畸形诊断的上述缺点。为实现上述目的，本专利技术提供了一种二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒，所述试剂盒包括：流动相A、流动相B、校正品、标准品；其中流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，校正品为亮氨酸脑啡肽，标准品为甘油一酸酯(monoglyceride，MG)和甘油磷酰乙醇胺的混合物(glycerophospho-N-oleoylethanolamine，GNOE)。优选地，所述标准品中甘油一酸酯和甘油磷酰乙醇胺的体积比为18:2。优选地，流动相B的流量为0.3-0.5ml/min，最佳为0.4ml/min。优选地，所述二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒还包括甲醇。进一步，所述二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒还包括盒体和试剂固定件。进一步，所述二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒是用于液相色谱或液质联用检测系统的。优选地，本专利技术检测的样本为血清样本。优选地，本专利技术的试剂盒还包括ZS值计算公式：ZS＝0.007×CGNOE+0.006×CMG-5.867；式中，CGNOE代表待测样本中GNOE的含量，CMG(18:2)代表待测样本中MG(18:2)的含量；在一些情况下，含量可以用化合物峰的峰面积来表示，在另一些情况下，含量可以用经过换算获得的样本中化合物浓度来表示；以及在其它情况下，可以采用任何能体现化合物含量的数值来表示。无论用何种数值表示化合物含量，都需要为ZS设定一个阈值，若待测样本ZS值大于阀值，检测结果为阳性，否则为阴性。在不同的实验条件下，或针对不同的人群可以设定不同的ZS阈值。本专利技术通过对血清样本的检测，在液相色谱—质谱联用技术的原理下，采集血清各个物质的信号，对数据分析，通过制定受试者工作特征曲线(ROC曲线)，得出联合检测MG与GONE的峰值，根据峰值计算ZS值，检测，曲线下面积(AUC)最大。本专利技术采取的ZS检测模式对二叶式主动脉瓣畸形的特异度和敏感度均为最高。附图说明图1是本专利技术试剂盒的一个较佳实施例的立体结构示意图；图2是图1中试剂盒的俯视图；图3是QC样品阳离子和阴离子模式下的总离子色谱图；图4是BAV患者和健康对照受试者在阳离子模式和阴离子模式下的PCA分数，PCA＝主成分分析；图5是PLS-DA在阴离子模式和阳离子模式下的验证，PLS-DA＝偏最小二乘判别分析；图6是评估组和验证组MG(18:2)、GNOE、PE(18:2)和ZS在主动脉瓣畸形患者预测的ROC曲线，AUC＝曲线下面积，ZS＝zhongshan，ROC＝受试者工作特征曲线。具体实施方式实施例1如图1和图2所示为本专利技术一种二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒的结构示意图，该试剂盒由盒体1、试剂固定件2、流动相A3、流动相B4、校正品5、甲醇6和标准品7组成。流动相A3为0.1％(v/v)甲酸水溶液，规格为6mL/瓶×1。流动相B4为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，规格为6mL/瓶×1。校正品5为标准亮氨酸脑啡肽样品，规格为1mL/瓶×1。甲醇6为德国默克公司生产的高效液相色谱法级别的甲醇，规格为12mL/瓶×1。标准品7为甘油一酸酯和甘油磷酰乙醇胺18:2(v/v)的混合物，规格为1mL/瓶×1。实施例2用实施例1中的试剂盒进行血清样本的检测将待测冰冻血清标本置于室温下，取100微升血清标本与300微升的甲醇6，充分涡旋30秒，随后于4℃，12000转/分钟，离心15分钟。离心完成后，取200微升上清液。液相色谱—质谱联用仪：以下所述过程均在安捷伦6530Q-TOF液质联用仪系统下运行。在运行时，取所述的待测上清液4微升分别装载在Zorbax色谱柱(C18,100mm×2.1mm,1.8μm，安捷伦)下。将Zorbax色谱柱置于40℃，使用流动相A3和流动相B4后，对血清样本进行分离。流动梯度初始设置为5％(v/v)流动相B，持续2分钟，然后至少11分钟后均匀增长至95％的流动相B，并且额外维持这个梯度2分钟。在阳离子和阴离子模式下使用氮气作为雾化气和气帘气，可以分别获得50-1000m/Z的质谱信号。将设备参数设置如下：阳离子模式：源温度100℃、毛细管电压4kV、锥孔电压35kV、引出电压4V、脱溶剂气温度350度、气帘气流量50L/h、脱溶剂气流量600L/h、扫描时间0.03s、扫描间隔0.02s；阴离子模式：毛细管电压3.5kV、锥孔电压50kV、脱溶剂气温度350度、脱溶剂气流量600L/h，其他参数不变。另取所有待测血清样本的等量混合物作为质控样本。取校正品5作为内参。将标准品7按照上述过程检测。数据分析阶段：采集待测血清样本与标准品共同出现的峰位所对应的峰值(峰面积)，即待测血清样本的MG与GONE(18:2)的峰值，从而计算ZS值，其表达式为：ZS＝0.007×CGNOE+0.006×CMG-5.867(峰面积的归一化比值)式中，CGNOE代表待测样本中GNOE的含量，CMG(18:2)代表待测样本中MG(18:2)的含量均用峰面积表示。通过前期实验设定ZS的阈值，若待测标本ZS值大于阀值，可认为待测标本的检测结果为阳性，否则为阴性。实施例3选取在2014年1月至2015年5月于复旦大学附属中山医院经过心超诊断为BAV，并且将要进行手术干预的76个患者，和体检显示健康的40名健康人。其中对BAV患者的诊断指南为《AHA/ACC的心脏瓣膜病患者管理指南》。排除标准包括药物使用、糖尿病、肺脏疾病、射血功能损害、心脏衰竭、瓣膜感染以及高血压。本实施例中的2类人群进行实施例2中的样本处理和液相色谱—质谱联用仪处理后得到数据。数据分析：从阳离子模式和阴离子模式获得的原始LC-MS数据首先要经过单位权方差和均值中心化处理(使用XCMSonline(https://xcmsonline.scripps.edu/))，所有样本在标准化处理后输入SIMCA-p12.0Software(UmetricsAB,Umea,Sweden)进行多元统计分析。没有被检测到的物质(数值过小)峰值面积取值为0.01。主要使用三种分析方法：主成分分析(PCA)，偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，来鉴定两类人群代谢物质差异。引入变量投影重要性(variableimportanceintheprojection(VIP))评估每一种经过OPLS-DA模型验证的代谢物质。同时，进行T检验(用SPSS22.0软件(SPSS,Inc.,Chicago,IL,USA))计算P值。筛查标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒，其特征在于其包括：流动相A、流动相B、校正品、标准品；其中流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，校正品为亮氨酸脑啡肽，标准品为甘油一酸酯和甘油磷酰乙醇胺的混合物。

【技术特征摘要】
1.一种二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒，其特征在于其包括：流动相A、流动相B、校正品、标准品；其中流动相A为0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液，校正品为亮氨酸脑啡肽，标准品为甘油一酸酯和甘油磷酰乙醇胺的混合物。2.如权利要求1所述的二叶式主动脉瓣畸形筛查试剂盒，其特征在于还包括ZS值计算公式：ZS＝0.007×CGNOE+0.006×CMG-5.867；式中，CGNOE代表待测样本中GNOE的含量，CMG(18:2)代表待测样本中MG(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文硕，魏来，王春生，陆云涛，孔彪，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31