CPS1报告基因人肝细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了CPS1报告基因人肝细胞系及其构建方法与应用，用氨基酰基磷酸合成酶1(CPS1)和报告基因构建人肝细胞系，获得的CPS1报告基因人肝细胞具有人原代成体肝实质细胞的功能，包括白蛋白分泌、细胞色素P450酶代谢和氨代谢功能，可应用于人工肝、药物代谢研究、药物毒性评价或药物筛选中，具有广阔的应用前景。

CPS1 reporter gene human liver cell line and construction method and application thereof

The invention discloses a reporter gene CPS1 in human liver cell line and its construction method and application of amino acyl phosphate synthase 1 (CPS1) and reporter gene construct human liver cell line, the CPS1 reporter gene in human liver cells with primary human adult liver parenchyma cell functions, including albumin secretion, cytochrome P450 enzyme ammonia metabolism and metabolic function, can be used in artificial liver, drug metabolism, drug toxicity or drug screening, and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
CPS1报告基因人肝细胞系及其构建方法与应用
本专利技术属于生物工程领域中的重组细胞系，特别是涉及一种氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)-报告基因人肝细胞系及其构建方法与应用。
技术介绍
在所有参与药物生物转化的器官中，肝脏是最主要的场所。药物在肝脏的代谢是药物消除的一种主要方式。由于药物在肝脏的代谢直接与其药理活性和毒性特征相关，进而影响药物在临床上的安全性和有效性。因此，药物在肝脏的代谢是临床前新药研发过程中的一个非常重要的环节。采用合理、有效的模型预测药物作用及潜在的毒性对药物代谢的评价至关重要。相对于整体模型来说，体外研究模型以其快速、准确、高通量的优势在药物的肝脏生物转化研究中被药物研发的科学工作者广泛使用，然而在这些模型中，肝细胞性状及相关代谢功能的维持对获得相对准确的药物代谢评价尤为重要。毋庸置疑，来源于正常组织的原代肝细胞和组织切片，具有I、II相代谢酶活性，是进行临床前药物代谢研究最为理想的体外平台。然而，由于受到来源、细胞分离及培养方法各异、细胞活性差异巨大等因素的限制，原代培养人肝细胞并不能满足大规模的药物安全性筛选需要。此外，体外培养的肝细胞迅速丢失大部分生物学本文档来自技高网...

【技术保护点】
CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法，包括以下步骤：1)构建携带靶向CPS1基因的单链向导RNA(sgRNA)编码序列的骨架载体sgCPS1；2)构建CPS1基因的打靶载体CPSLR‑2A‑tdTomato；3)将骨架载体sgCPS1和打靶载体CPSLR‑2A‑tdTomato转染到人肝细胞系中，经筛选获得稳定的tdTomato标记CPS1的CPS1‑tdTomato报告人肝细胞系。

【技术特征摘要】
1.CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法，包括以下步骤：1)构建携带靶向CPS1基因的单链向导RNA(sgRNA)编码序列的骨架载体sgCPS1；2)构建CPS1基因的打靶载体CPSLR-2A-tdTomato；3)将骨架载体sgCPS1和打靶载体CPSLR-2A-tdTomato转染到人肝细胞系中，经筛选获得稳定的tdTomato标记CPS1的CPS1-tdTomato报告人肝细胞系。2.根据权利要求1所述的CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中用于构建骨架载体sgCPS1的工具载体包括px458、px330、px461和px333，优选为pX458。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：以工具载体pX458为出发载体构建携带CPS1基因的单链向导RNA(sgRNA)的骨架载体，包括以下步骤：1.1)设计靶向CPS1基因(GenBank号：1373)的sgRNA，根据CPS1sgRNA序列获得CPS1基因的靶标序列AGCTGTGCAGAAATCTCGCA(位于CPS1基因自5’端第4759-4778位碱基)，根据CPS1基因的靶标序列获得CPS1sgRNA编码序列，在CPS1sgRNA编码序列两端加上BbsI酶切序列，最终获得包含CPS1sgRNA编码序列的寡核苷酸序列如下：oligo1:5’-CACCAGCTGTGCAGAAATCTCGCA-3’(带下划线碱基为BbsI酶切序列)，oligo2:5’-TTTGACGCTCTAAAGACGTGTCGA-3’(带下划线碱基为BbsI酶切序列)；1.2)将合成的包含CPS1sgRNA编码序列的寡核苷酸oligo1和oligo2进行退火并磷酸化；1.3)将工具载体pX458用BbsI进行酶切，回收、纯化酶切工具载体pX458；1.4)将退火及磷酸化的包含CPS1sgRNA编码序列的寡核苷酸oligo1和oligo2连入经酶切的工具载体pX458中；1.5)将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂布于Amp+培养平板，37℃孵育过夜(16-20小时)；1.6)从生长出的单克隆细菌中提取重组质粒，得到携带CPS1sgRNA编码序列的重组骨架载体，命名为pX458-sgCPS1，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。4.根据权利要求1或2或3所述的CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中用于构建CPS1基因打靶载体的出发载体为包含tdTomato的原核表达载体，包括但不限于pET-tdTomato、pQE-tdTomato、pUC-tdTomato等，优选为pET32-tdTomato。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：以pET32-tdTomato为出发载体构建CPS1基因打靶载体，包括以下步骤：2.1)获得CPS1基因的左臂插入片段(CPSL)和右臂插入片段(CPSR)，左臂插入片段(CPSL)的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：王韫芳，王怡，常乐，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11