本发明专利技术公开了一种未变性天然鱼胶原的制备方法。其特点是选取富含胶原蛋白的冷冻海产鱼皮或新鲜河鱼皮１００重量份，用醚２－５重量份或与水以任意比例混合的非离子表面活性剂５－１０重量份溶液中浸泡５－２４小时，过滤，用０．１－４Ｍ ＥＤＴＡ溶液５００－７００重量份中搅拌处理２４－４８小时。过滤后的沉渣１００重量份，加入蛋白酶１０－２０重量份，用酸调节ｐＨ＝２－４，于温度４－６℃搅拌１－３天，离心过滤得到的胶原溶液中加入０．５－５ＭＮａＣｌ盐析、反复处理３－５次，膜透析处理３次，得到浓度为０．５－２％的高纯度未变性天然鱼胶原蛋白液。用差热仪测得变性温度河鱼天然胶原为２０－２８℃、海产鱼天然胶原１２－２５℃，电泳法测得其含有α链、β链和γ链的分子量分别为１０万、２０万和３０万。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，属于生物医用材料的制备领域。
技术介绍
胶原蛋白或称胶原，是一种纤维状蛋白质，是重要的动物蛋白之一。胶原广泛地存在于各类动物体内，从脊椎动物到鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类等动物的皮肤、腱、软骨、各种内脏器官、血管壁以及食道等处都有胶原。脊椎动物体内所有蛋白质中胶原占据了总量的30％，是主要的结构蛋白质，皮肤含有胶原50％以上。未变性天然胶原(即生物活性胶原)，是一种生物大分子，分子量约为30万。其结构仍然保持在动物体内时的天然结构，即胶原的三股螺旋结构，这种天然胶原蛋白被看作是生物体的一个组成部分而不被认为是外来物质。天然胶原有利于细胞的存活和生长、能促进血小板凝结、低抗原性和良好的生物相容性等功能，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复方面已得到广泛应用。Chi H.Lee，Anuj Singla andYugyung Lee，Biochemical applications of collagen，International Journal of Pharmaceutics，2001，2211-22.由于未变性天然胶原还具有优良的保湿性能和促进表皮细胞生长繁殖，所以可有效地增强皮肤弹性、减少皱纹，所以也用于高档化妆品中。Chvapil，M.andEckmayer，Z.，Role of proteins in cosmetics，International Journal of Cosmetic Science，1985，741-49。未变性天然胶原的广泛应用必然对胶原的需求量和质量的要求越来越高。目前国内所使用的未变性天然胶原主要来自于猪和牛等屠宰动物的皮肤或跟腱中，但由于全球一体化趋势等因素，使疯牛病和口蹄疫等动物传染性疾病在全球普遍流行，并且目前尚无有效的治疗方法。于是探求更高质量和更高安全性的天然胶原的来源就显得非常重要。而从人体如胎盘中提取的胶原虽安全，但数量有限。相对于猪、牛等陆生动物胶原蛋白，水产动物胶原蛋白在使用安全性方面显示其优势。Yuko Ushiki，ShunjiHattori and Shinkichi Irie，Safety aspect of collagen as a raw material for biomedicalapplication，Fragrance Journal，1997，742-47。世界上海域辽阔，海岸线长，海洋渔业资源丰富，种类繁多。仅鱿鱼的捕获量，每年世界总量就达250万吨以上，中国每年鱿鱼的捕获量也有近25万吨。海洋生物的多样性、多量性都决定了海洋生物在胶原方面的利用，且鱼类，特别是海洋鱼类受环境污染小，可以得到最天然安全的天然胶原。中国是一个水产大国，无论海产鱼还是河鱼都相对丰富。几条大江贯串了整个中国，河鱼是内陆地区的主要食物之一，尽管也受到环境方面的一些影响，但随着科学养鱼的发展，各种鱼类数量日益增多。因此，鱼胶原提取用原材料是相当可观的。目前从鱼类提取的鱼胶原蛋白主要用于(1)啤酒、葡萄酒等生产过程中的澄清剂；Roger B.Boulton，Vernon L.Singleton，Linda F.Bisson，Ralph E.Kunkee著，赵光鳌，尹卓容，张继民，杨明，李记明译，《葡萄酒酿造学——原理及应用》，中国轻工业出版社，2001，P276-277。(2)美容饮料。秦玉青，刘承初，鱿鱼皮胶原蛋白的测定与回收，《上海水产大学学报》，2002，11(2)138-144。这些鱼胶原蛋白主要成分是水解胶原蛋白，而水解胶原蛋白是已经发生变性了的胶原蛋白，它不具有生物活性，不属于未变性天然胶原的范畴。由于鱼生长在水中，鱼生活的环境决定了鱼胶原的变性温度低于陆生动物猪、牛等胶原的变性温度。一般从猪、牛的组织提取的未变性天然胶原变性温度为38-44℃，而河鱼天然胶原的变性温度为20-28℃，海产鱼类天然胶原的变性温度更低，一般只有12-25℃(因鱼的种类不同而不同)。由于鱼类胶原变性温度低，现有从猪、牛等陆生动物组织提取未变性天然胶原的制备技术并不适宜制备未变性天然鱼胶原。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足而提供一种，其特点是用有机溶剂和非离子表面活性剂脱脂，EDTA溶液除钙，于低温和酸性条件下用蛋白酶提取获得未变性天然鱼胶原。本专利技术的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。1、原料的预处理选用富含胶原的冷冻海产鱼皮或新鲜河鱼皮，去鳞、去肉，切成0.2-2cm的小块100重量份，用醚2-5重量份，浸泡5-24小时或与水以任意比例混合的非离子表面活性剂5-10重量份浸泡5-24小时，过滤，加入0.1-4M EDTA溶液500-700重量份浸泡24-48小时，搅拌，过滤。所有操作的温度为4-6℃。所得沉渣作为以下提取原料备用。2、未变性天然鱼胶原的提取预处理后的鱼皮碎块100重量份，蛋白酶10-20重量份，用酸调节pH＝2-4，在4-6℃低温下处理1-3天，获得未变性天然鱼胶原蛋白液。3、提取物的纯化将上述胶原蛋白液用16000-20000rpm高速离心机分离，除去滤渣，上清液中加入0.5-5M NaCl盐析，所得沉淀经离心分离后用0.1-2M乙酸溶解，如此反复盐析操作3-5次，再经膜透析处理3次，获得浓度为0.5-2％的未变性天然鱼胶原纯溶液。脱脂剂为乙醚、石油醚、乙二醇乙醚或者脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚非离子表面活性剂脱脂中的至少一种。蛋白酶为胃蛋白酶、537蛋白酶或者真菌复合酶中的任一种。制得的天然鱼胶原用差式扫描量热计进行测试，得到的未变性天然鱼胶原测试结果详见图1所示。结果表明河鱼胶原变性温度为20-28℃，海产鱼胶原变性温度为12-25℃。分子量测试采用SDS-PAGE凝胶电泳法，详见图2所示。结果表明其α链、β链、γ链分子量分别为10万、20万和30万。这种具有生物活性的未变性天然鱼胶原可代替猪、牛天然胶原用于组织工程、外科手术用止血纤维等生物医学领域，也可用于高级美容化妆品、保健品。四附图说明图1为鱼胶原的DSC热变性温度测试图。图2为鱼胶原的SDS-PAGE电泳分离图。五具体实施例方式下面通过实施例对本专利技术进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本专利技术的内容，作出一些非本质的改进和调整。实施例1将宰杀后的新鲜草鱼，取皮，除去鳞片，刮去多余的肉类组织，用高纯水洗净后，切成0.2-2cm的小碎块，取小碎块100g，加入乙醚2g、石油醚3g混合液中浸泡24小时，在0.5M EDTA溶液700g中搅拌24小时。用酸调节pH至2-4，加入胃蛋白酶12g，于温度为4-6℃，搅拌48小时。离心除去未溶解部分，上清液中加入1MNaCl盐析，用2M乙酸溶解沉淀，盐析反复处理3次。得到澄清的浓度为1-2％的粘稠状未变性天然鱼胶原溶液500g。实施例2取已经水洗干净的冷冻鱿鱼皮，用高纯水洗净后，切成0.2-2cm的小碎块，取100g，放入乙二醇乙醚3g、脂肪酸聚氧乙烯醚2g、烷基酚聚氧乙烯醚3g中浸泡24小时，在1M EDTA溶液600g中搅拌24小时，用酸调节pH至2.5-3本文档来自技高网...
【技术保护点】
未变性天然鱼胶原的制备方法，其特征在于： （１）原料的预处理 选用富含胶原的冷冻海产鱼皮或新鲜河鱼皮，去鳞、去肉，切成０．２－２ｃｍ的小块１００重量份，用醚２－５重量份，浸泡５－２４小时或与水以任意比例混合的非离子表面活性剂５－１０重量份浸泡５－２４小时，过滤，加入０．１－４Ｍ ＥＤＴＡ溶液５００－７００重量份浸泡２４－４８小时，搅拌，过滤，所有操作的温度为４－６℃，所得沉渣作为以下提取原料备用。 （２）未变性天然鱼胶原的提取 将上述已预处理的原料１００重量份，蛋白酶１０－２０重量份，用酸调节ｐＨ＝２－４，于温度４－６℃下缓慢搅拌１－３天，得到未变性天然鱼胶原蛋白液。 （３）提取物的纯化 将上述鱼胶原蛋白液，用１６０００－２００００ｒｐｍ高速离心机分离，除去滤渣，上层清液加入０．５－５Ｍ ＮａＣｌ盐析，所得沉淀经离心分离后用０．１－２Ｍ乙酸溶解，如此反复盐析处理３－５次，再经膜透析处理３次，获得浓度为０．５－２％的高纯度未变性天然鱼胶原溶液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李国英，石碧，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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