基于FRET用于检测样品中核酸靶标的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了基于FRET用于检测样品中核酸靶标的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括供体核酸片段；受体核酸片段；能与所述受体核酸片段结合的第一核酸适配体；能与所述供体核酸片段结合的第二核酸适配体；能使所述第一核酸适配体与所述第二核酸适配体结合的SplintR连接酶。本发明专利技术试剂盒无需包含复杂的DNA-RNA杂交结构核酸适配体，仅需设计合成全DNA单链核酸适配体即可实现对微小RNA的有效准确检测，在临床应用中具有更好的实用性价值，并可在此基础上提供可实现多种生物标记物的高灵敏快速均相检测的方法。

【技术实现步骤摘要】
基于FRET用于检测样品中核酸靶标的试剂盒及其应用
本专利技术属于分析检测领域，涉及基于FRET(荧光共振能量转移)用于检测样品中核酸靶标的试剂盒及其应用。
技术介绍
国民经济的高速发展极大提升了国民对健康的关注。为在获得高标准健康的同时实现健康的低成本，亟需开发新型的诊断技术或药物筛选方法。荧光共振能量转移(FRET)是指两种荧光物质在超近距离(<10nm)时发生能量转移的现象。受激发的供体以非辐射方式把能量转移给受体荧光物质，使其发光。这种荧光共振能量转移在生物分析化学领域作为一种简便快捷的检测模式已越来越受到青睐，并在体外诊断领域，药物筛选等领域得到广泛的应用。其中，以镧系偶合物为荧光共振能量转移供体的检测模式，相比一般荧光检测方法，可以有效的去除散色、自发荧光等样品对荧光检测的干扰，大大提高信噪比，从而提高检测灵敏度和检测准确性。微小RNA因在分子生物学层面对生命现象起着极其重要的调控作用，而成为近年来备受瞩目的明星生物分子。人体中有2500种以上的微小RNA，它们通过控制绝大部分基因的转录-翻译过程调控细胞内蛋白质的平衡。多种重大疾病的重要病发机理之一已被确证是微小RNA的失控表达。微小RNA在血液内的稳定性高，其与各种疾病早期诊断、预后具有高关联性，从而使其体外诊断成为未来诊断技术的重要前沿课题。要将微小RNA作为实用型疾病诊断的有效生物标记物，其重要前提是方便准确地建立对血清、组织细胞、相应RNA提取物中的微小RNA进行分析定量的方法，但由于微小RNA通常只有18-24个碱基的长度且序列之间具有高相似性，使得传统检测中单纯依靠杂交的模式难以有效应用。目前微小RNA的检测通常利用实时荧光定量PCR，但该技术存在难以避免的背景扩增，且所需检测仪器价格昂贵，无法在临床实验室得到广泛应用。目前均相检测法备受临床实验室青睐，该方法避免了洗涤、离心等繁琐的人工操作，大大简化对人力、装备的要求，因此发展一种微小RNA的均相检测技术对于实现微小RNA成为诊断疾病的有效可靠生物标记物有着重要的意义。2015年，巴黎十一大学的NikoHildebrandt教授工作组首次将基于镧系偶合物的时间分辨荧光共振能量转移检测技术应用在多组分微小RNA的快速诊断上(Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,1-7)，实现了同一样本中3种微小RNA的同时检出。微小RNA的准确检出依赖于获得其与核酸探针稳定结合，形成有效能量转移结构，此过程中需要用到T4RNA连接酶2(T4RNAligase2)，而该连接酶只能识别核酸片段5’端骨架为RNA的结构，因此，对核酸适配体的设计要求苛刻，该核酸适配体必须同时满足既能与待测微小RNA序列互补，又拥有5’端为RNA结构的要求。为满足该要求，NikoHildebrandt教授工作组只能合成一种由DNA和RNA骨架共同构成的核酸适配体，这极大提高了检测成本及探针的设计、合成难度，限制了该方法的应用范围。目前尚未有研究可以解决规避该复杂结构核酸适配体，转为仅仅采用DNA核酸探针的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供基于FRET用于检测样品中核酸靶标的试剂盒，该试剂盒包括SplintR连接酶，使用该试剂盒无需采用由DNA和RNA骨架共同构成的核酸适配体即可实现基于FRET来检测核苷酸靶标。本专利技术的另一目的在于提供一种基于FRET用于检测样品中核酸靶标的生物传感体系的构建方法。本专利技术的再一目的在于提供一种SplintR连接酶在制备基于FRET用于检测样品中核酸靶标的试剂盒中的应用。本专利技术的再一目的在于提供一种基于FRET检测样品中核酸靶标的方法。为实现上述目的，本专利技术提供基于FRET用于检测样品中核酸靶标的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)供体核酸片段；(ii)受体核酸片段；(iii)能与所述受体核酸片段结合的第一核酸适配体；(iv)能与所述供体核酸片段结合的第二核酸适配体；(v)能使所述第一核酸适配体与所述第二核酸适配体结合的SplintR连接酶。本专利技术中所述的SplintR连接酶(ligase)为商业化产品，可购自于新英格兰生物实验(NewEngland)。根据本专利技术的具体实施方案，在本专利技术所述试剂盒中，所述供体核酸片段为标记第一荧光物质的供体核酸片段或为生物素化供体核酸片段；所述第一荧光物质包括镧系偶合物；优选地，所述镧系偶合物包括时间分辨荧光检测用激发态寿命大于50ns的荧光物质；更优选地，所述激发态寿命大于50ns的荧光物质包括铽的荧光化合物(luminescentterbiumcomplex，L4Tb)或铕的荧光化合物(luminescenteuropiumcomplex，L4Eu)；任选地，当所述供体核酸片段为生物素化供体核酸片段时，所述试剂盒还包括使其成为标记第一荧光物质的供体核酸片段的试剂，优选地，该试剂为L4Tb标记的链霉亲和素；所述受体核酸片段为标记第二荧光物质的受体核酸片段；所述第二荧光物质与所述第一荧光物质具有两者间能发生共振能量转移的光谱特性；所述第二荧光物质包括有机荧光染料、纳米荧光材料和荧光蛋白质中的一种或多种；优选地，所述有机荧光染料包括Cy3、Cy5或Cy5.5；所述纳米荧光材料包括量子点纳米荧光材料或碳点纳米荧光材料；所述荧光蛋白质包括CFP、GFP、YFP或RFP。根据本专利技术的具体实施方案，在本专利技术所述试剂盒中，所述第一核酸适配体还含有与所述核酸靶标的第一部分序列完全互补或部分互补的序列，其中，所述第一部分序列位于所述核酸靶标的3'或5'端；所述第二核酸适配体含有与所述受体核酸片段完全互补或部分互补的序列；且所述第二核酸适配体还含有与所述核酸靶标的第二部分序列完全互补或部分互补的序列，所述第二部分序列位于所述核酸靶标的另一端，所述核酸靶标的第二部分序列的每一端位于所述的核酸靶标的第一部分序列的外部；优选地，所述第二部分序列为所述核酸靶标除所述第一部分序列外的剩余序列。根据本专利技术的具体实施方案，在本专利技术所述试剂盒中，所述的供体核酸片段、受体核酸片段、第一核酸适配体或第二核酸适配体为单链的DNA；所述核酸靶标包括微小RNA、ssRNA和siRNA中的一种或多种，优选链长小于等于30bp的微小RNA，更优选地，所述微小RNA为miR-208a。本专利技术所述miR-208a具有SEQIDNO:5序列；SEQIDNO:5’-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’。根据本专利技术的具体实施方案，在本专利技术所述试剂盒中，所述供体核酸片段为SEQIDNO:1；所述受体核酸片段为SEQIDNO:2；所述第一核酸适配体为SEQIDNO:3；所述第二核酸适配体为SEQIDNO:4。SEQIDNO:15’-CGATCAGTCAGGCAA-3’。SEQIDNO:25’-TTGTGTTCCGATAGGCTAAAAAA-3’。SEQIDNO:35’-TTGCCTGACTGATCGCGCCAATATTT-3’。SEQIDNO:45’-ACGTGCTGCTAAGCCTATCGGAACACAA-3’。优选地，所述SEQIDNO:1的5’端标记有L4Tb；或其5’端标记有TEG-生物素；任选地，当所述SEQIDNO:1的5’端标记有TEG-生物素时，所述试剂盒还本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于FRET用于检测样品中核酸靶标的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)供体核酸片段；(ii)受体核酸片段；(iii)能与所述受体核酸片段结合的第一核酸适配体；(iv)能与所述供体核酸片段结合的第二核酸适配体；(v)能使所述第一核酸适配体与所述第二核酸适配体结合的SplintR连接酶。

【技术特征摘要】
1.基于FRET用于检测样品中核酸靶标的试剂盒，所述试剂盒包括：(i)供体核酸片段；(ii)受体核酸片段；(iii)能与所述受体核酸片段结合的第一核酸适配体；(iv)能与所述供体核酸片段结合的第二核酸适配体；(v)能使所述第一核酸适配体与所述第二核酸适配体结合的SplintR连接酶。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述供体核酸片段为标记第一荧光物质的供体核酸片段或为生物素化供体核酸片段；所述第一荧光物质包括镧系偶合物；任选地，当所述供体核酸片段为生物素化供体核酸片段时，所述试剂盒还包括使其成为标记第一荧光物质的供体核酸片段的试剂，优选的，该试剂为L4Tb标记的链霉亲和素；所述受体核酸片段为标记第二荧光物质的受体核酸片段；所述第二荧光物质与所述第一荧光物质具有两者间能发生共振能量转移的光谱特性；所述第二荧光物质包括有机荧光染料、纳米荧光材料和荧光蛋白质中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述镧系偶合物包括时间分辨荧光检测用激发态寿命大于50ns的荧光物质；优选地，所述激发态寿命大于50ns的荧光物质包括铽的荧光化合物或铕的荧光化合物。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述有机荧光染料包括Cy3、Cy5或Cy5.5；所述纳米荧光材料包括量子点纳米荧光材料或碳点纳米荧光材料；所述荧光蛋白质包括CFP、GFP、YFP或RFP。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一核酸适配体含有与所述供体核酸片段的序列完全互补或部分互补的序列；且所述第一核酸适配体还含有与所述核酸靶标的第一部分序列完全互补或部分互补的序列，其中，所述第一部分序列位于所述核酸靶标的3'或5'端；所述第二核酸适配体含有与所述受体核酸片段完全互补或部分互补的序列；且所述第二核酸适配体还含有与所述核酸靶标的第二部分序列完全互补或部分互补的序列，所述第二部分序列位于所述核酸靶标的另一端，所述核酸靶标的第二部分序列的每一端位于所述的核酸靶标的第一部分序列的外部；优选地，所述第二部分序列为所述核酸靶标除所述第一部分序列外的剩余序列。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述的供体核酸片段、受体核酸片段、第一核酸适配体或第二核酸适配体为单链的DNA；所述核酸靶标包括微小RNA、ssRNA和siRNA中的一种或多种，优选链长小于等于30bp的微小RNA，更优选地，所述微小RNA为miR-208a。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述供体核酸片段为SEQIDNO:1；所述受体核酸片段为SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：金宗文，罗擎颖，袁静，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44