一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法技术

本发明专利技术属于分子遗传生物学及发育生物学领域，公开了一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，所述以慢病毒为工具的在体基因沉默方法包括：利用微量进样器注射病毒；2天鸡胚，在气室打洞，目视确定气室膜位置，将进样器插入气室正中膜下，将病毒注入。本发明专利技术建立了以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，并成功建立了PPARalpha在体沉默鸡胚模型。本发明专利技术的方法较为简便，目视下即可完成操作，成本低，实用性强，成活率可达80％，在心脏转染效率高，在体沉默效率可达70％左右。在体转染完整保留了复杂的发育信号转导过程，可作为研究目标基因在发育中所发挥作用的有力工具。

An in vivo gene silencing method using lentivirus as a tool

The invention belongs to the field of molecular biology and developmental biology, discloses a lentivirus as a tool in vivo gene silencing method, the lentivirus as a tool for the in vivo gene silencing methods: using microsyringe injection 2 virus; chicken embryo, the hole in the gas chamber, the chamber was determined visually the film will be inserted into the injector position, gas chamber middle membrane, injected the virus. The present invention establishes an in vivo gene silencing method using lentivirus as a tool, and successfully establishes a PPARalpha in vivo silent chick embryo model. The method of the invention is simple and convenient, and the operation can be completed by sight, the cost is low, the practicability is strong, the survival rate can reach 80%, and the efficiency of the transfection of the heart is high, and the efficiency of the silencing in the body can reach 70%. In vivo, transfection is complete, retaining complex developmental signaling processes and can serve as a powerful tool for studying the role of target genes in development.

【技术实现步骤摘要】
一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法
本专利技术属于分子遗传生物学及发育生物学领域，尤其涉及一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法。
技术介绍
基因操作是研究特定基因在生命活动中所起作用的必须方法，经典的方法是基因敲除(Knockout)，其能有效去除目标基因，但相对成本高昂且耗时较长，同时，由于其对生物基因组的改变，可能带来一些未知的副作用，降低研究的可靠性。siRNA是近年来发现的一种能特异性识别并抑制、降解特定mRNA，从而在不改变DNA的前提下降低目标基因蛋白表达水平的小分子RNA，其已被广泛应用于沉默目的基因以研究其在特定生物活动中所起的作用。常见的将siRNA导入细胞的方法有电穿孔法，脂质体法及病毒法等。其中病毒法具有持续时间长，效率高等优点，但是，一般以慢病毒介导的siRNA基因沉默均以离体细胞为目标，病毒需要直接接触宿主细胞来达到转染效果，如果注射于整体动物，则由于能应用的病毒量的限制，只能局部转染少量组织，且不能达到均匀转染，方法的应用价值不大。离体细胞是经典的研究工具，但其有一定的局限性，只由一种或数种细胞组成，没有真正的生物体内复杂的微环境，神经体液调控等等，因此不能满足复杂的在体机制研究需要，特别是像发育这样需要多种细胞在复杂的信号通路下共同进行的过程，无法以离体细胞模型模拟，因此目前的发育研究很难应用慢病毒沉默技术，而多用传统的基因敲除法。综上所述，现有技术存在的问题是：现有在整体生物中的基因操作方法成本高昂而耗时较长，容易引起未知的副作用，而慢病毒介导的siRNA沉默又基本上只用于离体细胞模型，不能满足复杂的整体机制研究需要，需要开发一种能以现有的慢病毒介导，在整体生物中起基因沉默作用的方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法。本专利技术是这样实现的，如果应用成年动物为模型，有限的慢病毒注射不可能有效地转染全身的大量细胞，而应用鸡胚则可克服这一问题，在鸡胚发育的早期，整个鸡胚的细胞数量并不多，只要将适量慢病毒在适当的时间点注入鸡胚，将足以转染绝大部分鸡胚细胞，同时由于慢病毒的特点，siRNA的表达将永久性地随子代细胞的分裂而传递下去，令孵化后的雏鸡乃至成年后的鸡都一直带有基因沉默的特性。一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，所述以慢病毒为工具的在体基因沉默方法包括：步骤一，利用微量进样器注射病毒；步骤二，2天鸡胚，在气室打洞，目视确定气室膜位置，将进样器插入气室正中膜下，将病毒注入。进一步，所述步骤一中利用5ul的微量进样器注射病毒。进一步，所述步骤一中注射量设定为每20g蛋重注射1ul，病毒滴度统一为3x108TU/ml。进一步，所述步骤二中在气室打开直径1.5mm～2mm的洞。进一步，所述步骤二中将进样器插入气室正中膜下1mm～2mm，将病毒注入。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述以慢病毒为工具的在体基因沉默方法建立的PPARalpha在体沉默鸡胚模型。本专利技术的优点及积极效果为：方法较为简便，目视下即可完成操作，只需无菌环境，细锥子一把，不到一百元人民币的国产微量进样器一支和常见的透明胶带即可进行，建立了以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，并成功建立了PPARalpha在体沉默鸡胚模型，在15天时，鸡胚成活率可达约80％，经westernblot测定，PPARalpha在15天鸡胚心脏中的表达效率较对照组降低可达约70％，而其他研究报导的在离体细胞模型中的慢病毒沉默效率数据绝大多数在50％-70％之间，说明本方法在整体动物模型中达到了不亚于，有时甚至优于现有离体细胞模型中的沉默效果。目前，国际上并未有公认的PPARalpha敲除或沉默的鸡胚模型，而只有PPARalpha在小鼠的敲除模型，本专利技术填补了一项技术上的空白。在体转染完整保留了复杂的发育信号转导过程，可以成为有力的分析目标基因在发育过程中所起作用的工具。(例：分析PPARalpha是否在某物质诱导的发育心脏毒性中起作用，即可在体沉默PPARalpha，再应用分析的物质，观察在PPARalpha沉默的情况下，其发育心脏毒性是否还存在)。附图说明图1是本专利技术实施例提供的以慢病毒为工具的在体基因沉默方法流程图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。如图1所示，本专利技术实施例提供的以慢病毒为工具的在体基因沉默方法包括以下步骤：S101：利用5ul的微量进样器注射病毒，注射量设定为每20g蛋重注射1ul，病毒滴度统一为3x108TU/ml；S102：2天鸡胚，在气室打开直径约1.5-2mm的洞，目视确定气室膜位置，小心地将进样器插入气室正中膜下约1-2mm，将病毒注入。下面结合试验对本专利技术的应用原理作进一步的描述。将慢病毒导入整体鸡胚内，利用5ul的微量进样器注射病毒，注射量设定为每20g蛋重注射1ul，病毒滴度统一为3x108TU/ml。初步设计四种注射方案：1，0天鸡胚(发育前)，在气室小心地打开直径约3mm的洞，撕开气室膜，暴露胚盘，在目视下直接将病毒注入。2，0天鸡胚(发育前)，在气室打开直径约1.5-2mm的洞，目视确定气室膜位置，小心地将进样器插入气室正中膜下约1-2mm，将病毒注入。3，2天鸡胚，操作同方案1，撕开膜后直接暴露2天鸡胚，目视下注入病毒。4，2天鸡胚，操作同方案2。所有注射方法均严格无菌操作，最终以透明胶带封口后，正常培养。第一批预实验进行至六天，发现存活率为：方案1，30％，方案2，70％，方案3，0％，方案4，80％，说明打开直径3mm洞并撕开气室膜的操作无法保证鸡胚存活，淘汰方案1，3，以方案2，4进行第二轮预实验。与此同时，将6天鸡胚置于凝胶成像仪下蓝光激发，初步确认了转染慢病毒后绿荧光的存在。2.转染效率的筛选：第二轮预实验以方案2，4进行实验，培养部分鸡胚至6天，取出在凝胶成像机下成像，部分至15天，取出心脏冷冻切片，在荧光显微镜下成像检测绿荧光，结果提示，两种方案均有绿荧光蛋白表达，但方案2的表达效率远不及方案4，推测可能与0天时胚胎尚未发育，可供侵染的细胞太少，血供不发达，无法及时将病毒输送至胚胎全身有关，故最终确定以方案4进行后续实验，即在2天鸡胚，气室开一小洞注射于气室正中膜下约1-2mm。3.基因沉默效率的筛选：沉默pparalpha慢病毒的设计构建由上海吉凯基因进行，得到三种慢病毒(标记为V1,V2,V3)，如前所述，将其注射于两天鸡胚内，培育至15天，取出鸡胚心脏，冷冻切片确定绿荧光蛋白表达(结果见附件)，结果表明，三种病毒均可有效地令绿荧光蛋白表达，V3效率稍低。以westernblot检测pparalpha表达水平，结果显示，v1无明显沉默，v3沉默效率仅33.4％，而v2沉默效率达到69.8％，是理想的沉默pparalpha的病毒，pparalpha基因胚胎在体沉默模型构建成功，可用以研究pparalpha在正常及异常发育中所起的作用。将pparalpha沉默慢病毒换为其他慢病毒应仍可行，可广泛用于发育过程中特定基因所起作用的研究。以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，其特征在于，所述以慢病毒为工具的在体基因沉默方法包括：步骤一，利用微量进样器注射病毒；步骤二，2天鸡胚，在气室打洞，目视确定气室膜位置，将进样器插入气室正中膜下，将病毒注入。

【技术特征摘要】
1.一种以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，其特征在于，所述以慢病毒为工具的在体基因沉默方法包括：步骤一，利用微量进样器注射病毒；步骤二，2天鸡胚，在气室打洞，目视确定气室膜位置，将进样器插入气室正中膜下，将病毒注入。2.如权利要求1所述的以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，其特征在于，所述步骤一中利用5ul的微量进样器注射病毒。3.如权利要求1所述的以慢病毒为工具的在体基因沉默方法，其特征在于，所述步骤一中注射量设定为...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜启晓，赵萌，韩彦弢，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东,37