本发明专利技术一株降解土壤中新烟碱类农药的菌株，其分类命名为镰刀菌(Fusarium.sp)，菌株号为CS‑3，保藏编号为CCTCC NO：M 2017137，保藏日期为2017年3月21日。本发明专利技术菌株CS‑3为好氧型微生物，最适生长温度为30℃，最适生长pH为7.0，菌株CS‑3在96h内可以完全降解50mg/L的啶虫脒，并利用其作为唯一碳源生长，本发明专利技术对生物处理新烟碱类农药污染的土壤具有重要的应用价值。
Strain for degrading nicotine pesticide in soil and application thereof
The invention of a new neonicotinoid pesticide in soil degradation strains, the classification named Fusarium (Fusarium.sp), CS strain No. 3, the preservation number is CCTCC NO:M 2017137, the collection date is March 21, 2017. The invention strain CS 3 for aerobic microorganisms, the optimum growth temperature of 30 DEG C, the optimum growth pH was 7, 3 strains of CS in 96h 50mg/L can completely degrade acetamiprid, and use it as the sole carbon source for growth, the invention has important application value for biological treatment of neonicotine pesticide contaminated soil.
【技术实现步骤摘要】
一株降解土壤中新烟碱类农药的菌株及其应用
本专利技术属于生物处理
，涉及一株高效降解土壤中新烟碱类农药的菌株及其应用。
技术介绍
新烟碱类杀虫剂来源于植物源农药烟碱，主要作用于害虫的乙酰胆碱酯酶受体。烟碱很早就被人们用作杀虫剂，早在17世纪民间就有了用烟叶粉杀虫的历史。新烟碱类杀虫剂是继有机氯、有机磷、拟除虫菊酯、氨基甲酸脂之后，推出的一类高效、高选择性的新型杀虫剂，由于其杀虫谱广、用量低、作用机制新颖等特点，在国内外市场得到了快速的发展。啶虫脒是氯化烟碱类杀虫剂的代表性品种，属于亚甲基杂环类化合物，广泛用于水稻尤其是蔬菜、瓜果的蚜虫、飞虱以及部分鳞翅目害虫等的防治，由于广泛的在农业生产生活的使用，啶虫脒广泛的存在于环境中，极易通过土壤进入地下水等饮用水资源，其在土壤和水环境中不易降解，不仅会破坏土壤的结构，阻碍或抑制土壤中微生物的生命活动，对人类的身体健康存在着潜在的威胁。农药在土壤中的残留备受关注，利用微生物修复是一种有效的措施。微生物由于广泛的存在于自然界、并且具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，在农药的生物降解过程中起到了重要作用。相比细菌，真菌具有较强的抗毒性和环境适应能力，生长环境要求不高，易培养。镰刀菌是一种常见的真菌，在环境中广为存在，其对营养要求不高，容易培养。当前国内外研究者已分离到一些啶虫脒的降解菌，并研究了其降解特性，但大多主要集中在细菌方面，对真菌的研究很少，尤其是镰刀菌对啶虫脒的降解在国内尚无报道。王光利等分离得到菌株Pigmentiphagasp.AAP-1在2.5h内可以完全降解100mg/L的啶虫脒。SwapnilS.Phugare等分离得到菌株Rhodococcussp.BCH2能将250mg/L的啶虫脒降解14％。因此，筛选高效广谱降解新烟碱类农药啶虫脒的菌株，在土壤的微生物的修复中具有潜在的应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对土壤中啶虫脒残留问题，提供一种高效广谱降解新烟碱类农药啶虫脒的菌株。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述菌株在土壤修复过程中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一株降解土壤中新烟碱类农药的菌株，其分类命名为镰刀菌(Fusarium.sp)，菌株号为CS-3，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO：M2017137，保藏日期为2017年3月21日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。本专利技术所述的Fusarium.spCS-3筛选方法：在以啶虫脒为唯一碳源的无机盐养基(pH7.0)中，对含啶虫脒的土壤降解菌株进行分离筛选。具体地，以含啶虫脒的土壤菌群作为筛选目标，利用含40mg/L啶虫脒的无机盐培养基作为介质，连续富集驯化具有啶虫脒降解能力的菌株，将富集培养基稀释涂布至含有200mg/L啶虫脒的无机盐固体培养基，30℃培养3-4d，挑取在平板上有透明圈的的啶虫脒降解菌株进行划线分离获得纯培养，命名为菌株CS-3，再次验证纯种微生物菌株CS-3对农药啶虫脒的降解能力，利用液相色谱检测啶虫脒的残余含量；具体地，所述的无机盐培养基是用硝酸铵1.0g，氯化钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.1g加水定容至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂15.0g，15min、121℃灭菌，使用前添加终浓度40mg/L的啶虫脒作为碳源。本专利技术所述的Fusarium.spCS-3在YPD固体培养基上生长较快，30℃，72h可形成直径为4cm的黄白色菌落，菌落大且呈绒毛状，无光泽，干燥，粗糙，不透明，营养菌丝紧紧的插如培养基中，菌株Fusarium.spCS-3生理生化鉴定的结果与镰刀菌属的特征最为接近。具体地，所述的YPD培养基是由蛋白胨20.0g，葡萄糖20.0g，酵母粉15.0g，加水定容至1.0L配制，调节pH值至7.0，固体培养基加入琼脂15.0g、20min、115℃灭菌。一种含有本专利技术所述的啶虫脒降解菌株Fusarium.spCS-318SrDNA序列的克隆载体。所述的重组克隆载体，优选出发载体为pMD19T。含所述的啶虫脒降解菌株Fusarium.spCS-318SrDNA序列的基因工程菌EscherichcoliDH5α(pMD19T-18S)。所述的基因工程菌EscherichcoliDH5α构建方法：利用引物ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`和ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`扩增菌株CS-3的18SrDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-18S，将其转化到克隆宿主菌EscherichcoliDH5α获得重组微生物EscherichcoliDH5α(pMD19T-18S)，将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该18SrDNA序列，在分子水平上将菌株CS-3鉴定至镰刀菌属。上述菌株CS-3在降解土壤中新烟碱类农药中的应用也在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的新烟碱类农药优选为啶虫脒。其中，土壤中啶虫脒浓度为50-100mg/L。一株新烟碱类农药啶虫脒降解菌株Fusarium.spCS-3在土壤农药残留处理过程中的应用，具体步骤如下：(1)菌株CS-3种子液培养：菌株CS-3种子液采用YPD液体培养基培养，取平板保藏的菌株CS-3，用接种环挑去菌落接入含有100mLYPD液体培养基的三角瓶，30℃振荡培养48小时，摇床转速180r·min-1，获得的菌体经无机盐培养基重悬洗涤两次后，菌悬液作为降解试验种子液；(2)菌株CS-3降解啶虫脒的动力学：在无机盐培养基中添加终浓度为50mg/L的啶虫脒，按5％v/v接种量接入种子液，于30℃，180r·min-1振荡培养，每隔2h取样一次，HPLC检测啶虫脒的残留浓度。(3)温度和底物初始浓度对菌株CS-3降解啶虫脒的影响：在啶虫脒终浓度为50mg/L的无机盐培养基中，按5％接种量接入种子液，分别于20℃、25℃、30℃、37℃、42℃，pH7.0，180r·min-1振荡培养；分别于啶虫脒初始浓度50mg/l、100mg/1、150mg/l、200mg/l的无机盐培养基中，按5％v/v接种量接入种子液，30℃、180r·min-1振荡培养，测定温度和啶虫脒初始浓度对菌株CS-3降解啶虫脒的影响。(4)菌株CS-3对啶虫脒中间产物2-氯-5羟甲基吡啶的降解能力测定：在终浓度为100mg/L的含2-氯-5羟甲基吡啶的无机盐培养基中，按5％v/v接种量接入种子液，于30℃，180r·min-1振荡培养，高效液相色谱(HPLC)测定菌株CS-3对2-氯-5羟甲基吡啶的降解能力。本专利技术的有益效果在于：与现有技术相比，该菌株对啶虫脒的降解是高效的，且是第一次有报道镰刀菌可以降解啶虫脒。此外，该菌株对含啶虫脒残留土壤的修复能力也是高效的，适合应用在农药残留土壤的生物治理上。附图说明图1是菌株CS-3降解啶虫脒效果图。图2a是温度对菌株CS-3生长的影响示意图。图2b是pH值对菌株CS-3生长的影响示意图。图3a是温度对菌株CS-3降解啶虫脒的影响示意图。图3b是底物初始浓本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株降解土壤中新烟碱类农药的菌株，其分类命名为镰刀菌(Fusarium.sp)，菌株号为CS‑3，保藏编号为CCTCC NO：M 2017137，保藏日期为2017年3月21日。
【技术特征摘要】
1.一株降解土壤中新烟碱类农药的菌株，其分类命名为镰刀菌(Fusarium.sp)，菌株号为CS-3，保藏编号为CCTCCNO：M2017137，保藏日期为2017年3月21日。2.权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：董维亮，史周坤，马江锋，信丰学，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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