一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性成分及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分及其制备方法。包括以下步骤：(1)黑胫病菌菌丝在液体培养基中摇床振荡培养；收集无菌发酵液，离心，将上清液过滤除菌，待用；(2)将步骤(1)得到的除菌后的黑胫病菌无菌发酵液通过微滤中空纤维素膜和超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离，得到澄清透明的超滤液；将超滤液上柱进行大孔吸附树脂富集后用乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到乙醇脱洗液，即黑胫病菌发酵液致病活性组分。本发明专利技术操作简单、结果可靠、黑胫病菌发酵液致病活性组分的致病能力强，稳定性好，能够高效用于烟草黑胫病菌抗性品种的筛选。

Pathogenic active component of fermented liquid of tobacco black shank fungus and preparation method thereof

The invention relates to a pathogenic active component of a fermented liquid of tobacco black shank fungus and a preparation method thereof. Includes the following steps: (1) black shank mycelium in liquid medium for shaking culture; collecting sterile fermentation liquid, centrifugation, the supernatant filtration, for use; (2) the step (1) black shank sterile fermentation liquid obtained after the membrane filtration by microfiltration and ultrafiltration hollow hollow cellulose membrane cellulose membrane separation, then clear and transparent ultrafiltrate; ultra filtrate column macroporous resin with ethanol will be adsorbed on the resin composition down, get off the ethanol solution, namely the black shank fungus fermentation liquid pathogenic active component. The invention has the advantages of simple operation, reliable result, strong pathogenic ability and good stability of the pathogenic active component of the fermented liquid of the black shank fungus, and can be used for screening the resistant varieties of tobacco black fungus effectively.

【技术实现步骤摘要】
一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性成分及其制备方法
本专利技术属于病理学领域，特别涉及一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性成分及其制备方法。
技术介绍
烟草黑胫病最早在印度尼西亚的瓜哇被发现。1950年首次报道该病发生于我国黄淮烟区，并长时间为害且病情越来越严重。目前烟草黑胫病除东北烟区零星发病外，全国其他烟区均普遍发生，每年造成的经济损失严重，仅次于病毒病。当前，防治烟草黑胫病的常用化学药剂主要有瑞毒霉(甲霜灵)可湿性粉剂、波尔多液、甲基托布津、敌克松可湿性粉剂、杀毒矾M-8可湿性粉等，期间多种药剂可联合施用，分时分期喷洒，具有理想的防病增产作用。此外，寻找新的防治方法以克服烟叶农药残留和病菌抗药性的问题，生物防治的多样性决定了防治方法的多样性，也保证了烟草黑胫病的生物防治途径的多样性。国外有研究表明：在烟草黑胫病的防治工作中，木霉菌拮抗效果突出，主要缘于木霉菌在土壤中占据了侵染点位后，与黑胫病菌产生竞争，进而降低烟草黑胫病菌的侵染几率。随着烟草行业不断向绿色无公害方向发展，对烟草黑胫病的防治仅仅停留在合理轮作为主、起垄栽培和化学防治为辅的综合防治措施已不能满足发展的需求。生物防治中寻找拮抗烟草黑胫病的菌株虽然也能在一定程度上有效防治烟草黑胫病菌，但只有烟草品种的抗病性本身才是防治病害的基础，因而对抗性品种的研究是当今烟草领域的一个热门话题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分及其制备方法。本专利技术的制备方法操作简单、结果可靠、致病能力强，稳定性好，能够高效用于烟草黑胫病菌抗性品种的筛选。一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的制备方法，步骤包括：(1)黑胫病菌菌丝在液体培养基中摇床振荡培养；收集无菌发酵液，离心，将上清液过滤除菌，待用；(2)将步骤(1)得到的除菌后的黑胫病菌无菌发酵液通过微滤中空纤维素膜和超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离，得到澄清透明的超滤液；将超滤液上柱进行大孔吸附树脂富集后用80-95％的乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到80-95％乙醇洗脱液，即黑胫病菌发酵液致病活性组分。作为进一步的改进，步骤(1)所述的液体培养基为马铃薯液体培养基。作为进一步的改进，步骤(1)中的摇床培养条件：26-30℃、180-250rpm，优选28℃,220rpm。作为进一步的改进，步骤(1)中从培养后的第5d-7d收集无菌发酵液，优选第7d。作为进一步的改进，步骤(1)中4℃、6000-10000rpm离心10-20min，优选8000rpm离心15min；将上清液经0.22um细菌过滤器过滤除菌，保存于4℃冰箱中待用。作为进一步的改进，步骤(2)中采用的是5KDa微滤中空纤维素膜和3KDa超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离。作为进一步的改进，步骤(2)中采用的是D101型大孔吸附树脂。作为进一步的改进，步骤(2)中采用的乙醇浓度是95％。一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分，是由上述的方法制备而成的。本专利技术黑胫病菌发酵液活性组分的致病力的测定：首先采用离体叶片注射法，先用1ml无菌注射器针头在烟草叶片主脉两侧不对称的位置刺3个孔，然后用装有黑胫病菌发酵液活性组分的无菌注射器注孔抵压住己刺孔部位，将发酵液缓慢注射入表皮之间，每孔注射量控制在0.2ml左右；然后将无菌滤纸包住烟叶叶柄处，放入培养皿中，置于培养房中培养，室温在25℃左右，每天喷水于滤纸上，光照12h，观察记录烟草叶片注射区的变化，根据叶片注射区的发病情况即HR反应(病斑的有无、大小及产生的早晚)判断诱导黑胫病菌的致病力。本专利技术的制备方法操作简单、结果可靠、致病能力强，稳定性好，能够高效用于烟草黑胫病菌抗性品种的筛选。附图说明图1为V8培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶HR反应；从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液HR反应；图2为胡萝卜培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶HR反应；从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液HR反应；图3为燕麦培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶HR反应；从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液HR反应；图4为烟叶汁培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶HR反应；从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液HR反应；图5为马铃薯培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶HR反应；从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液HR反应；图6为黑胫病菌发酵液不同处理的烟叶HR反应；图7为烟草高钾品系HKDN-2的花药抗黑胫病菌原液和发酵液活性成分最适选择压的筛选比较；图8为烟草高钾品系HKDN-5的花药抗黑胫病菌原液和发酵液活性成分最适选择压的筛选比较；图9为黑胫病菌发酵液活性组分花培幼苗的黑胫病抗性鉴定；(注：H.R表示高抗；M.R表示中抗；A表示盆栽鉴定；B表示大田；C表示大田单株)图10为黑胫病菌原液花培幼苗的黑胫病抗性鉴定；(注：H.S表示高感；A表示移盆栽鉴定；B表示大田；C表示大田单株)。具体实施方式以下实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。黑胫病菌发酵液的制备及其活性组分的分离：首先接种环挑取适量菌丝块于马铃薯液体培养基中，置于28℃、220rpm的摇床中培养，从第7d收集无菌发酵液于10ml的无菌离心管中，4℃、8000rpm离心15min，将上清液经0.22um细菌过滤器过滤得到黑胫病菌发酵液；然后将其过5KDa微滤中空纤维素膜和3KDa超滤中空纤维素膜处理，得到澄清透明的超滤液；最后将滤液经6kgD101型大孔吸附树脂，后用95％乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到95％乙醇洗脱液。实施例1：黑胫病菌无菌发酵液致病效果(1)V8培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果由图1可知：与对照(CK)(CK为培养0天)相比，黑胫病菌振荡培养5天后获得的发酵液已使叶片注射区出现轻微凹陷状，伴有白色圈点，经一段时间振荡培养，至第7天后，所取发酵液使叶片注射区出现凹陷状和圈点。但总体来说，烟叶均未出现明显HR坏死斑现象。(2)胡萝卜培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果由图2可知：黑胫病菌培养5天后所取得的黑胫病菌无菌发酵液对叶片的注射结果与对照(CK)一样，无HR反应，培养6天后，所取得的发酵液使叶片的注射孔周围开始出现轻微白色斑点，培养7天与培养6天相比，白色斑点增多，面积扩大，并伴随着注射区烟叶大范围凹陷。综合整个培养周期来看，未产生明显HR坏死斑现象。(3)燕麦培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果从图3可知：培养0天(CK)的黑胫病菌无菌发酵液对烟叶无HR反应。黑胫病菌培养了5天的发酵液对烟叶即有轻微影响，伴有白色斑点出现，培养了6天的黑胫病菌无菌发酵液与5天的相比，烟叶注射区产生的白色斑点较大，培养7天后，所取得的黑胫病菌无菌发酵液即使烟叶注射区产生黄色斑点，有产生HR反应的趋势但并不明显。(4)烟叶汁培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果由图4可知，培养0天(CK)的黑胫病菌无菌发酵液对烟叶未产生明显的注射效果，黑胫病菌培养5天后，所取得的黑胫病菌无菌发酵液即使烟叶注射区出现白色凹陷，伴有白色斑块，部分斑块存在变黄的现象，培养6天和7天所取的黑胫病菌无菌发酵液对叶片的注射效果与培养5天的相比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的制备方法，其特征在于，步骤包括：(1)黑胫病菌菌丝在液体培养基中摇床振荡培养；收集无菌发酵液，离心，将上清液过滤除菌，待用；(2)将步骤(1)得到的除菌后的黑胫病菌无菌发酵液通过微滤中空纤维素膜和超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离，得到澄清透明的超滤液；将超滤液上柱进行大孔吸附树脂富集后用80‑95％的乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到80‑95％乙醇洗脱液，即黑胫病菌发酵液致病活性组分。

【技术特征摘要】
1.一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的制备方法，其特征在于，步骤包括：(1)黑胫病菌菌丝在液体培养基中摇床振荡培养；收集无菌发酵液，离心，将上清液过滤除菌，待用；(2)将步骤(1)得到的除菌后的黑胫病菌无菌发酵液通过微滤中空纤维素膜和超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离，得到澄清透明的超滤液；将超滤液上柱进行大孔吸附树脂富集后用80-95％的乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到80-95％乙醇洗脱液，即黑胫病菌发酵液致病活性组分。2.根据权利要求1所述的烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的液体培养基为马铃薯液体培养基。3.根据权利要求1所述的烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的摇床培养条件：26-30℃、180-250rpm，优选28℃,220rpm。4.根据权利要求1所述的烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的制备方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴林建，陈武，钟军，周田，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43