巯基选择性水溶性聚合物衍生物制造技术

本发明专利技术提供了带有适合于选择性偶联诸如那些包含在蛋白质半胱氨酸残基中的巯基的巯基选择性末端的水溶性聚合物衍生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及制备诸如聚乙二醇这类水溶性聚合物的巯基选择性衍生物的方法。本专利技术特别涉及(i)制备在至少一个末端上带有适合于与蛋白质或其它活性剂的巯基偶联的巯基、被保护的巯基或其它基团的聚合物的方法；(ii)巯基选择性聚合物自身；(iii)其轭合物；和(iv)这类聚合物的使用方法。
技术介绍
由于近来生物技术的进展，目前可以大规模制备治疗蛋白和其它生物分子，例如抗体和抗体片段，使得这类生物分子得到更广泛的利用。令人遗憾的是，有潜力的治疗生物分子的临床应用通常因其快速蛋白水解降解、制备、储存或给药时的不稳定性或因其免疫原性而受到阻碍。由于持续关注为治疗应用而给药蛋白质和其它生物分子，所以已经研究了克服这些缺陷的各种手段。已经广泛研究的一种这类手段为通过共价连接诸如聚乙二醇或″PEG″这类水溶性聚合物修饰蛋白质和其它有潜力的治疗生物分子(Abuchowski，A.等人，J.Biol.Chem.252(11)，3579(1977)；Davis，S.等人，Clin.Exp Immunol.，46，649-652(1981)。在许多情况中，已经证实PEG-修饰的蛋白质、也称作PEG-轭合物或聚乙二醇化蛋白质的生物特性与其未聚乙二醇化对应物得到明显改善(Herman等人，Macromol.Chem.Phys.，195，203-209(1994)。已经证实聚乙二醇-修饰的蛋白质因对蛋白水解降解的耐受性增加而在体内具有较长的循环时间且还具有增加的热稳定性(Abuchowski，A.等人，J.Biol.Chem.，252，3582-3586(1977)。使用其它生物分子、例如抗体和抗体片段也观察到了类似的生物功效提高(Chapman，A.，Adv.Drug Del.Rev.54，531-545(2002))。一般来说，使用活化的PEG衍生物、即带有至少一个适合于与生物分子亲核中心(例如赖氨酸、半胱氨酸和类似的蛋白质残基)反应的活化末端的PEG使聚乙二醇与药物或其它表面连接。最常用的是基于PEG与诸如那些存在于蛋白质赖氨酸侧链上的活化蛋白质氨基反应的方法。带有适合于与蛋白质氨基反应的活化端基的聚乙二醇包括PEG-醛类(Harris，J.M.，Herati，R.S.，Polym Prepr.(Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem)，32(1)，154-155(1991)、混合的酸酐类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类、羰基咪唑类(carbonylimadazolides)和氯氰脲酸酯类(Herman，S.等人，Macromol.Chem.Phys.195，203-209(1994))。尽管已经证实许多蛋白质在PEG修饰过程中保持了活性，但是在某些情况中，诸如当特定的赖氨酸残基的衍生使蛋白质失活时，聚合物通过蛋白质氨基的连接可能并不理想(Suzuki，T.等人，Biochimica et Biophysica Acta788，248-255(1984))。因此，有利的是拥有使用另一种诸如半胱氨酸这类连接用靶氨基酸、通过PEG修饰蛋白质的其它方法。与半胱氨酸上的蛋白质巯基连接可以提供的优点在于半胱氨酸在蛋白质中一般不如赖氨酸丰富，由此减少蛋白质在与这些含有巯基的氨基酸轭合时失活的可能性。带有巯基-选择性活性端基的聚乙二醇衍生物包括马来酰亚胺类、乙烯基砜类、碘乙酰胺类、硫醇类和二硫化物。这些衍生物均用于与蛋白质的半胱氨酸侧链偶联(Zalipsky，S.，Bioconjug.Chem.6，150-165(1995)；Greenwald，R.B.等人，Crit.Rev.Ther.DrugCarrier Syst.17，101-161(2000)；Herman，S.等人，Macromol.Chem.Phys.195，203-209(1994))。然而，这些试剂中的许多因其难以合成和纯化而未得到广泛利用。例如，Woghiren等的方法(Woghiren，C.等人，Biocojugate Chem.4，314-318(1993))要求一系列合成转化和纯化步骤以形成特定的被巯基-保护的PEG试剂。首先，使甲氧基-PEG与甲苯磺酰氯反应，随后纯化反应产物以回收相应的甲苯磺酰基-PEG。然后通过与硫代乙酸盐反应、随后再进行一次纯化步骤而将甲苯磺酰基-PEG转化成相应的PEG-硫代乙酸盐。然后使用甲醇对PEG-硫代乙酸盐进行醇解，随后进行柱色谱法而得到纯化的硫醇盐，然后将其用二硫苏糖醇还原成相应的PEG-巯基。随后通过柱色谱法纯化所得的PEG巯基。然后通过使PEG-巯基与4，4′-二吡啶基二硫化物反应、随后通过柱色谱法纯化制备硫醇的被保护形式。概括的说，Woghiren的将EG转化成其巯基-被保护形式的方法需要5个不同的反应步骤和另外5个独立的纯化步骤，使得它以及其它类似的合成手段不理想且极其费时。尽管进行了多个纯化步骤，但是在许多现存的获得单官能巯基特异性PEG衍生物途经中的另一个明显的缺陷在于没有能力除去由存在于单官能PEG原料上的二醇产生的双官能化PEG。因此，存在对制备高纯度、活化的PEG-巯基和其它巯基-选择性PEG衍生物的方法的需求，该方法既是直接的又是简单的，即需要最少数量的反应和纯化步骤，同时可以维持PEG链段的完整性(即在适度反应条件下进行)，且该方法可以进一步以高产率提供高纯度的巯基-选择性PEG衍生物。本申请人已经研发了这类方法，在下文中更详细地描述。专利技术概述本专利技术在一个方面中提供了制备水溶性聚合物的巯基选择性衍生物(即带有至少一个为巯基选择性基团的末端的聚合物，即所述的巯基选择性基团为优选与诸如巯基、硫醇盐或被保护的巯基这类巯基反应的基团)的方法。更具体地说，该方法包括下列步骤(i)提供包括本文命名为″POLY″的水溶性聚合物链段的水溶性聚合物，所述的″POLY″带有用亲电体(-E)活化的末端，本文一般命名为″POLY-E″；随后(ii)使这类聚合物与包括亲核体(-NU)和巯基选择性结构部分的反应剂分子在有效促进亲电体与亲核体之间反应的条件下反应而形成带有巯基选择性末端的水溶性聚合物，本文命名为″POLY-S″，其中在该用语中″S″指的是巯基选择性结构部分。可以包含在反应剂分子中的巯基-选择性结构部分包括巯基、被保护的巯基、二硫化物、马来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酰胺和邻吡啶基二硫化物。在本专利技术的一个具体的实施方案中，所述的巯基选择性结构部分选自巯基、被保护的巯基和二硫化物组成的组。在反应剂分子中包含的巯基选择性结构部分为二硫键的情况中，所述的方法可以进一步包括还原POLY-S上的二硫键而形成带有末端巯基的水溶性聚合物(本文命名为″POLY-SH″)的步骤。在本专利技术的一个实施方案中，例如，当步骤(i)中提供的聚合物为封端的线性高聚物或仅带有一个反应性亲电末端的单官能活化的聚合物时，来自步骤(ii)的POLY-S产物组成中包括大于约95％摩尔百分比的所需单官能取代的POLY-S。在该实施方案中，以总聚合物成分为基准，优选步骤(i)中提供的聚合物为含有小于约5％聚环氧烷二醇和/或双官能亲电体活化的聚环氧烷二醇衍生物的组合的聚环氧烷。在另一个相关的实施方案中，例如，当起始聚合物为封端的或仅带有一个反应性亲电子末本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备水溶性聚合物的巯基选择性衍生物的方法，所述的方法包括下列步骤：　　　　（ｉ）提供包括水溶性聚合物链段（″ＰＯＬＹ″）的水溶性聚合物，所述的水溶性聚合物链段带有被亲电体（″－Ｅ″）活化的一个末端；和　　　　（ｉｉ）使所述聚合物与包括亲核体（″－ＮＵ″）和巯基选择性结构部分的分子反应，所述的巯基选择性结构部分选自巯基、被保护的巯基、二硫化物、马来酰亚胺、乙烯基砜、邻吡啶基二硫化物和碘乙酰胺组成的组，反应条件为有效促进所述的亲电体与所述的亲核体之间的反应，从而形成包括选自巯基、被保护的巯基、二硫化物、马来酰亚胺、乙烯基砜、邻吡啶基二硫化物和碘乙酰胺组成的组的巯基选择性末端的聚合物产物（″ＰＯＬＹ－Ｓ″）。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A科兹洛夫斯基，RF格罗斯三世，SP麦克马纳斯，
申请(专利权)人：尼克塔治疗亚拉巴马公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]