一种酶解多肽及用于抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种酶解多肽及用于抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移的用途，以知了猴为原料，由如下方法制备：将知了猴洗净后绞成肉糜，置于超纯水中，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：pH值，8.3‑8.7；酶解温度，53‑57℃；酶解时间，9‑11小时；酶解结束后，加热使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，8000‑10000rpm离心20‑30分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冻干即得不同分子量大小的酶解多肽。本发明专利技术提供的酶解多肽有望开发成预防小细胞肺癌患者化疗后出现肿瘤转移的药物。

An enzymatic polypeptide and uses for inhibiting the invasion and metastasis of small cell lung cancer stem cells

The invention discloses a method for inhibiting peptides and small cell lung cancer stem cell invasion and metastasis of the purpose, to know the monkey as raw material, the preparation method is as follows: the cicada monkey wash Jiaocheng meat, in ultra pure water, adding alkaline protease, enzymolysis conditions were: pH value, 8.3 8.7; enzymolysis temperature, 53 57 DEG C; enzymolysis time, 9 11 hours; after enzymolysis, heating the alkaline protease inactivation, cooling to room temperature; after cooling, 30 minutes, 8000 10000rpm 20 centrifugal Torikami Kiyo, freeze drying powder; freeze-dried powder is dissolved with ultrapure water that separation of the resulting peptides with different molecular weight cut-off ultrafiltration membrane, ultrafiltration peptide obtained component lyophilized to different molecular weights of enzyme. The enzymolysis polypeptide provided by the invention is hopeful to be developed into a medicine for preventing tumor metastasis of patients with small cell lung cancer after chemotherapy.

【技术实现步骤摘要】
一种酶解多肽及用于抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移的用途
本专利技术属于医药领域，涉及多肽药物的制备，具体涉及一种酶解多肽及用于抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移的用途。
技术介绍
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势，年平均增长近2％。肺癌根据病理学特点的不同分为多种组织类型，肺癌组织类型不同，其治疗措施也不同。根据2004版WHO分类，常见肺癌组织病理学分型分为非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。非小细胞癌又分为鳞状细胞癌(SCC)、腺癌(AC)和大细胞癌(LCC)。不同肺癌临床治疗方案不同，预后效果也不同。因此，为了提高治疗效果，肺癌的治疗策略已经从传统的以分期为基础的治疗模式转变为以组织学类型和基因突变为指导的个体化、精准的多学科治疗模式。个体化治疗提高了肺癌的治疗和预后效果。小细胞肺癌占肺癌总数的20％-25％，对化学治疗及放射治疗敏感，但易复发和发生远处转移，文献报道局限期小细胞肺癌的5年生存率为7％，广泛期仅为1％。近几年提出的肿瘤干细胞学说认为，在大部分肿瘤中潜伏着的极少量肿瘤干细胞是肿瘤复发和转移的根源。生物活性肽(Biologicallyactivepeptides,BAP)是一种具有特殊生理功能的小分子活性物质，如抗肿瘤、抗菌、抗高血压、抗病毒以及提高免疫力等，这些物质广泛存在于动物、植物以及微生物中。生物活性肽主要有4种来源，分别为蛋白酶解多肽、微生物发酵代谢多肽、天然活性多肽以及化学合成多肽。由于近几年来恶性肿瘤发病率的不断提高，而传统的化疗药物不仅毒副作用大而且治疗效果并不理想，因此，生物活性肽凭借其活性高、副作用小、针对性强的优势得到了国内外科研工作者的研究和关注。目前已经从多种生物中提取得到了抗肿瘤活性肽，其中动物来源的活性肽展现了广阔的前景。Hsu等分别用木瓜蛋白酶和蛋白酶XXⅢ酶解金枪鱼肉，分离纯化后得到了两种抗肿瘤活性较好的多肽(Antiproliferativeactivityoffishproteinhydrolysatesonhumanbreastcancercelllines.ProcessBiochemistry,2006,41:1217-1222)。这两条多肽对乳腺癌细胞MCF-7的IC50值达到了8.1和8.8μM。Leng等人通过SephadexG-25、FPLC并结合MALDI-TOF成功的从壳蛤中分离出了对胃癌细胞BGC-823有明显抑制作用的分子量为3147u活性肽，当肽的浓度为4.0μg/mL时其对癌细胞的抑制率达到了60％(InhibitoryeffectsofanticancerpeptidefromMercenariaontheBGC-823cellsandseveralenzymes.FEBSLetters,2005,579:1187-1190)。另外还分别从贻贝、泥蚶、海鞘、牡蛎等动物体内得到了抗肿瘤肽，这些都为以后动物体内抗肿瘤肽的提取奠定了基础。知了猴又称知了龟、爬蚱等，是金蝉的成熟若虫，蛋白含量非常高，具有较高的食用和药用价值。然而，目前对于知了猴多肽的提取、分离纯化及抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移方面的研究鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酶解多肽及用于抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移的用途。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种酶解多肽，以知了猴为原料，由如下方法制备：将知了猴洗净后绞成肉糜，置于超纯水中，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：pH值，8.3-8.7；酶解温度，53-57℃；酶解时间，9-11小时；酶解结束后，加热使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，8000-10000rpm离心20-30分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冻干即得不同分子量大小的酶解多肽。优选地，所述不同截留分子量的超滤膜包括截留分子量分别为10000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜。优选地，酶解多肽的分子量范围为3000-5000u。优选地，酶解多肽的分子量范围为1000-3000u。优选地，加热使碱性蛋白酶灭活的方法为：在80-90℃条件下水浴8-12分钟。优选地，加热使碱性蛋白酶灭活的方法为：在85℃条件下水浴10分钟。优选地，酶解条件为：pH值，8.5；酶解温度，55℃；酶解时间，10小时。优选地，离心条件为：9000rpm离心25分钟。优选地，所述碱性蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.4-0.5％。上述酶解多肽在制备预防小细胞肺癌患者化疗后出现肿瘤转移的药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的酶解多肽可以有效抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞样细胞侵袭和转移，毒理实验研究证明酶解多肽无明显毒副作用。肿瘤干细胞学说认为，在大部分肿瘤中潜伏着的极少量肿瘤干细胞是肿瘤复发和转移的根源，因此，本专利技术提供的酶解多肽有望开发成预防小细胞肺癌患者化疗后出现肿瘤转移的药物。附图说明图1为酶解多肽对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞转移、侵袭的影响。具体实施方式下面结合具体实施例和附图详细介绍本专利技术的技术方案和技术效果。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件，为本领域普通技术人员熟知或易于获知。实施例1酶解多肽的制备一、实验材料1、仪器试剂超滤杯和超滤膜购于上海摩速科学器材有限公司；碱性蛋白酶37017(1:2.5U/g)购于诺维信公司。2、实验样品收集刚出土上树的新鲜知了猴，保存在水中，于-20℃冻存。使用前于室温条件自然化冻。二、实验方法1、酶解方法将知了猴洗净后绞成肉糜，取10g肉糜置于50mL超纯水中，加入碱性蛋白酶进行酶解，碱性蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.45％，酶解条件为：pH值，8.5；酶解温度，55℃；酶解时间，10小时；酶解结束后，在85℃条件下水浴10分钟使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，9000rpm离心25分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉。2、纯化方法将冻干粉用超纯水溶解(1g冻干粉加10mL超纯水)，然后依次用截留分子量为10000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冷冻干燥(含水量≤5％)即得不同分子量大小的酶解多肽。超滤过程中控制CO2的压力使其小于0.25MPa。三、实验结果得到五个不同分子量范围的酶解多肽，分子量范围分别为：酶解多肽1，分子量为10000u以上；酶解多肽2，分子量介于10000u和5000u之间；酶解多肽3，分子量介于5000u和3000u之间；酶解多肽4，分子量介于3000u和1000u之间；酶解多肽5，分子量为1000u以下。实施例2酶解多肽对小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞侵袭和转移的影响本实施例实验方法参照文献方法操作(陈恭让等，紫花牡荆素抑制小细胞肺癌NCI-H446细胞系肺癌干细胞样细胞侵袭和转移的研究，中南药学2014年10月第12卷第10期)，并使用该文献中公开的紫花牡荆素作为阳性药。一、实验方法1、人小细胞肺癌NCI-H446细胞系的培养和传代人小细胞肺本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶解多肽，以知了猴为原料，其特征在于，由如下方法制备：将知了猴洗净后绞成肉糜，置于超纯水中，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：pH值，8.3‑8.7；酶解温度，53‑57℃；酶解时间，9‑11小时；酶解结束后，加热使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，8000‑10000rpm离心20‑30分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冻干即得不同分子量大小的酶解多肽。

【技术特征摘要】
1.一种酶解多肽，以知了猴为原料，其特征在于，由如下方法制备：将知了猴洗净后绞成肉糜，置于超纯水中，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：pH值，8.3-8.7；酶解温度，53-57℃；酶解时间，9-11小时；酶解结束后，加热使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温；冷却后，8000-10000rpm离心20-30分钟，取上清，冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜对所得到的酶解多肽进行分离，将超滤所得组分冻干即得不同分子量大小的酶解多肽。2.根据权利要求1所述的酶解多肽，其特征在于：所述不同截留分子量的超滤膜包括截留分子量分别为10000u、5000u、3000u以及1000u的超滤膜。3.根据权利要求2所述的酶解多肽，其特征在于：酶解多肽的分子量范围为3000-5000u。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：郭守河，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：南京九寿堂医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32