一种L-茶氨酸的合成方法技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种L-茶氨酸的合成方法，所述方法包括：以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。本发明专利技术方法以价格相对低廉的L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为起始原料，以可大量生产的克隆表达蛋白为催化剂，具有反应条件温和、专一性强、反应转化率高、操作简便、对反应设备要求低、环境污染小等优点。

Synthesis method of L- theanine

The invention relates to the technical field of biological engineering, and particularly relates to a method for synthesizing L- theanine, the method comprises: Gamma glutamyl phosphate synthase kinase and methylamine as catalyst to L- glutamate and ethylamine hydrochloride as the substrate of L- synthesis of theanine. The method of the invention to the relatively low price of L- glutamate and ethylamine hydrochloride as the starting material, expressed as a catalyst to clone can be produced in large quantities, with mild reaction conditions, high specificity, high conversion rate, simple operation, low requirements on reaction equipment advantages and less pollution etc..

【技术实现步骤摘要】
一种L-茶氨酸的合成方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种L-茶氨酸的合成方法，具体涉及一种利用微生物酶催化，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物偶合酶法ATP再生系统合成L-茶氨酸的方法。
技术介绍
L-茶氨酸(C7H14O3N2，又称γ-谷氨酰乙胺)是茶叶中所含的一种特殊氨基酸，具有多种用途：在普通食品中用于改善食品风味、强化营养等；在保健食品中用于镇静放松、改善睡眠、抗疲劳、提高学习记忆能力等；在医药领域已用于降低血压、预防癌症、预防阿尔茨海默症、控制抑郁症等。因此L-茶氨酸在饮料、功能食品、功能药物等方面有着广泛的需求。目前，L-茶氨酸的生产方法主要有提取法、化学法和生物法。提取法就是从茶叶组织中直接提取，由于茶氨酸在茶叶中含量很低，且原材料来源受限，导致生产成本过高，因而提取法并不适于大规模工业化生产。化学法合成L-茶氨酸均为谷氨酸衍生物与乙胺反应，涉及到谷氨酸的保护与脱保护，反应路线复杂，反应条件苛刻，副反应多，且容易产生消旋体，同时会有毒性物质残留，影响产品的品质。另外，会用到大量的有机溶剂，污染环境。酶法是近年来合成L-茶氨酸的新趋势，主要包括微生物发酵法和酶催化法。LiJian的“LWT-FoodScienceandTechnology”2008,41,883-889利用Xerocomusbadius(mushroom)发酵制备L-茶氨酸。微生物发酵法专属性强、条件温和、环境污染少，但是其存在产物浓度和转化率低、发酵时间长、产物分离难度大、设备成本高等缺点。酶催化是一种高选择性反应，不同种类的酶可作用于不同构型和不同种类的特定底物，从而达到定向转化的目的。目前，专利和文献所报道的生产L-茶氨酸的酶主要有CN102181501A和CN103409475A公开了γ-谷氨酰转肽酶，CN1688705A和JP2007185132A公开了谷氨酰胺酶，“Biosci.Biotechnol.Biochem.2007,71(2),545-552”公开了谷氨酰胺合成酶，“Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211”和CN104212757A公开了γ-谷氨酰甲胺合成酶，都具有生产L-茶氨酸的功能。与传统的化学方法相比，酶催化制备方法效率高、专一性强、反应条件温和，是一种理想的制备L-茶氨酸的方法。然而目前利用γ-谷氨酰转肽酶和谷氨酰胺酶合成L-茶氨酸时，通常反应pH为9.0-11.0，反应条件为碱性；所用底物为谷氨酰胺，价格相对昂贵。此外，两种酶均可使底物谷氨酰胺水解，反应转化率不高，因此，反应中需要添加过量的另一种底物乙胺(2.0-10.0eq)来抑制谷氨酰胺水解。谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰甲胺合成酶虽可在中性条件(pH6.5-7.5)转化价格低廉的谷氨酸钠和等当量的乙胺合成L-茶氨酸，但其为耗能反应，需要消耗当量的ATP。Yamamoto的“Biosci.Biotechnol.Biochem.”2005,69,784-789；Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211中报道，利用谷氨酰胺合成酶或γ-谷氨酰甲胺合成酶偶合酵母发酵能量循环，实现ATP再生来合成L-茶氨酸。然而此种ATP再生方法利用的是酵母内的糖酵解途径，需要多个步骤，因此效率相对较低；同时反应体系中还需要考虑细胞膜通透性的问题。另外，反应中影响活细胞代谢的因素较多，使反应体系变得复杂，不利于工业化生产。因此，需要开发一种低成本且易于工业化放大的酶催化合成L-茶氨酸的新方法。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种L-茶氨酸的合成方法，所述方法催化合成茶氨酸的同时实现反应中ATP再生。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种L-茶氨酸的合成方法，所述方法包括：以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。本专利技术中，所述L-茶氨酸的合成方法如下：利用磷酸激酶催化、以廉价易得的多聚磷酸盐为底物进行ATP再生，降低反应中ATP的添加量，实现ATP的循化利用。优选地，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。优选地，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorusmays。优选地，所述磷酸激酶来源于Eschierichiacoli、Rhodobactersphaeroides或Chloroflexusaurantiacus中的任意一种。优选地，所述克隆在同一表达载体上的γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段。所述核苷酸序列如下：SEQIDNO.1：ATGATGGCCGAAGATCGTGCTATGCCGGTTATGCCGCCGGCTGCTGACGCTGCTGAAGCCGTCCCGGCCGCTCCGACCGCCCTGCCGGAAGAAGGTCCGGCAGGTCCGGAAGCACCGCTGCAAACCCTGCATGGTCCGCGTCACTTTCCGGCAGTTGATGCGAACGCCATTCGCCAGGCTTTCGAAGGCGGTCATTATCCGTACCCGCGTCGCCTGGGCCGTGTGGTTTATGAAGCGGAAAAAGCCCGCCTGCAGGCAGAACTGCTGAAGGTCCAGATTTGGGCGCAAGAAACCGGTCAGAAATTTGTGATCCTGATGGAAGGCCGTGATGCGGCCGGTAAAGGCGGTACGATCAAGCGCTTCATGGAACATCTGAACCCGCGTTATGCACGCGTCGTGGCTCTGACCAAACCGGGCGAACGTGAACGCGGTCAATGGTTTTTCCAGCGTTACATTGAACACCTGCCGACGGCCGGCGAAATCGTGTTTTTCGATCGCAGCTGGTATAATCGTGCAGGCGTGGAACGCGTTATGGGTTTTTGCACCCCGTCTGAATACCTGGAATTTATGCGTCAAGCGCCGGAACTGGAACGTATGCTGGTTCGCTCAGGTATTCGTCTGTATAAATACTGGTTTTCGGTCACCCGCGATGAACAGCGTGCACGCTTCCTGGCCCGTGAAACGGACCCGCTGAAACGCTGGAAGCTGAGTCCGATTGATAAAGCGTCCCTGGACAAGTGGGATGACTATACCGAAGCAAAAGAAGCTATGTTTTTCTACACCGATACGGCAGACGCTCCGTGGACGATCGTGAAGTCCAACGATAAAAAGCGTGCCCGCCTGAATTGTATGCGTCACTTTCTGAGCTCTCTGGATTATCCGGGCAAAGACCCGGAAGTTGTCGGTGTCCCGGACCCGCTGATTGTGGGTCGTGCAGCTCAGGTTATCGGTACCGCTGCCGACATTCTGGACTCCGCCACCCCGCCGGCCCTGCGTAAACCGCGTCAAGGTTGAGTCGACAAGCTTAAGGAGATATAATGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种L‑茶氨酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括：以γ‑谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，以L‑谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L‑茶氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种L-茶氨酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括：以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂，以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。3.根据权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorusmays；优选地，所述磷酸激酶来源于Eschierichiacoli、Rhodobactersphaeroides或Chloroflexusaurantiacus中的任意一种。4.根据权利要求1-3中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述克隆在同一表达载体上的γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段。5.根据权利要求1-4中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶加入的总酶量为1-25g/L，优选为2-20g/L，进一步优选为5-15g/L。6.根据权利要求1-5中任一项所述的L-茶氨酸的合成方法，其特征在于，所述L-谷氨酸钠的加入量为50-400mM；优选地，所述乙胺盐酸盐的加入量为50-400mM；优选地，所述L-谷...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝俊，李元，刘珊，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12