一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法技术

本发明专利技术涉及磷酸化肽的高选择性富集，具体的说是一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法。本方法采用带有磷酸基团的单体进行聚合反应直接形成带有磷酸基团的聚合物材料。该材料用含锆离子的溶液作用后生成磷酸酯锆基团，使其可以从复杂的蛋白酶解液中特异地富集和纯化磷酸肽。本发明专利技术采用聚合的方法直接合成出含功能基团的聚合物材料，无需额外化学改性，具有简单方便的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及磷酸化肽段的分离纯化，具体的说是一种用于富集磷酸化 肽段的聚合物材料的制备方法。
技术介绍
蛋白翻译后修饰位点的鉴定是目前蛋白组学研究中重要挑战之一，磷 酸化修饰是蛋白翻译后最重要的修饰之一。因为可逆的蛋白磷酸化修饰反 应在细胞的信号传导，新陈代谢等方面调节着蛋白的活性功能。最近，质 谱技术在蛋白磷酸化的定性中，已经发展成为重要的工具之一。在磷酸化 蛋白酶解产物的磷酸化肽段质谱分析中，由于酶解产物中存在大量的非磷 酸化肽段，这些肽段在离子化过程中产生的离子信号会淹没磷酸化肽段的 离子信号，另一方面因为磷酸化肽段在质谱检测中相对较低的离子化效率， 这些因素导致了磷酸化肽段在质谱中很难被检测。从磷酸化蛋白的酶解混 合物中分离和富集磷酸化肽段是目前进行磷酸化研究的比较理想的方法， 也是成功实现质谱分析最关键的一步。为了提高对磷酸化肽段的检测，亲 和技术被应用到从复杂的混合样品中纯化和富集磷酸化肽段。最常用的亲和技术是固定化金属离子螯合亲和色谱(IMAC)，磷酸肽在IMAC上的保留 是基于其与固定相的螯合离子之间的螯合作用。常用的金属离子是铁(Fe,和镓(Ga3、 一般利用亚氨基二乙酸(IDA)为螯合基团将金属离子固载在 色谱介质上。虽然基于铁和镓的IMAC很常用，但是其特异性不强， 一些 酸性肽也会保留从而干扰磷酸肽的检测。基于利用锆离子和磷酸基团之间的强烈相互作用，最近我们发展 出了基于磷酸酯锆的新IMAC方法(Zr"-IMAC)。与常规IMAC相比， 该方法对磷酸化肽有更好的特异性。不同于 一 般的IMAC,在Zr4+-IMAC 中所用的螯合基团也是磷酸基团。在使用中首先将锆离子固载于磷酸基 团修饰的介质表面上形成磷酸酯锆表面，磷酸化肽由于其磷酸基团与 锆离子之间的强相互作用而获得特异性保留。为了制备这种带有磷酸基 团的色谱吸附材料，需要对材料表面进行改性，这需要多步化学反应，因 此比较费时费力。本专利技术提供了一种更为简单的制备这种材料的方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种用于富集磷酸化肽段的吸附材料的制备方 法。该方法利用带磷酸基团的单体进行聚合反应形成带磷酸基团的聚合物， 该聚合物敖合Zr"后，可用于磷酸化肽的高特异性富集。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为，采用带有烯键和磷酸基团的化合物单体，进行聚合反应，形成磷酸基团聚合物，该材料经 与锆离子作用后生成磷酸酯锆基团，可用于富集磷酸化肽段等带有磷酸基团白勺化合物。所述带有烯键和磷酸基团的化合物具有如式(I)结构，<formula>formula see original document page 4</formula>(i)R为CH2、 CH2CH2、 CH2CH2CH2之一，磷酸基团以磷酸酯键存在于 单体中，为磷酸一酯。 具体过程为，1) 以采用带有烯键和磷酸基团的化合物为功能单体、亚甲基双丙烯酰 胺作为交联剂，加入有机致孔剂，形成反应物料，进行热引发聚合反应， 形成磷酸基团聚合物；功能单体与交联剂的质量比为75-85: 55-65，致孔剂的加入量为反应 物料体积的75~85%;反应温度为50 80 °C;2) 将磷酸基团聚合物与10-lOOmM锆离子溶液接触，生成磷酸酯锆基 团，其可用于富集磷酸化肽段或带有磷酸基团的化合物。本专利技术具有如下优点本专利技术利用带磷酸酯基团的单体进行聚合反应直接形成带磷酸基团的 聚合物，其聚合物材料可以制备成整体柱模式，也可以制备成颗粒状态。该方法通过聚合反应的方法直接制备出带有磷酸基团的吸附材料，不 用对材料进行额外的化学反应，因而具有简单、方便的特点。附图说明图1为单体2—(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯与交联剂亚甲基双丙烯酰 胺聚合反应的化学表达式。图2为聚合物吸附材料富集和检测磷酸肽的过程。图3为聚合物整体材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和纯化的MALDI质谱图。图4为聚合物整体材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的富集和纯化的MALDI质谱图。图5为聚合物颗粒材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和纯化的MALDI质谱图。图6为聚合物颗粒材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的富集和纯化的MALDI质谱图。具体实施例方式本专利技术通过利用带磷酸酯基团的单体与交联剂聚合反应生成带有磷酸基团的聚合物，该聚合物敖合21"4+后可用于磷酸化肽的富集。为了制备聚合 物材料，首先需要配制聚合物反应液。单体和交联剂是反应液的主要成份， 它们发生聚合反应后形成聚合物骨架。为了调节聚合物的物理化学性质， 可以使用多种单体，但其中必须包括一种带有磷酸基团的单体。多孔材料 有更大的表面积，因此有更高的吸附容量。为了制备多孔的聚合物，需要 在反应液中加入一定比例的致孔剂。致孔剂是一些有机溶剂，它们不参与 聚合反应，在聚合反应发生后它们所占据的空间将形成孔。通过调节致孔 剂在反应液中的比例可以很方便的调节聚合物中孔的大小和机械强度。此 外， 一般还需要加入少量的引发剂来引发聚合反应。获得带有磷酸基团的聚合物后，将聚合物浸泡在Zr"的溶液(如ZrOCl2溶液)中，Zr"离子由于与 聚合物上的磷酸基团有强相互作用而固载在聚合物材料上，形成磷酸酯锆 修饰的表面。磷酸酯锆修饰的聚合物材料可以用于选择性提取蛋白质酶解 液中的磷酸肽。单体2—(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯与交联剂亚甲基双丙烯酰胺聚合 反应生成的聚合物具有很好的亲水性，因此非特异性很小，是亲和色谱良 好的载体。以下两实施例均采用上述体系，但本专利技术并不局限于上述体系。实施例l聚合物整体柱的制备整体柱是一种特殊的液相色谱柱，它是将聚合物反应液灌入柱管中通 过原位聚合的方法形成多孔的、连续的聚合物。聚合物整体柱由于有很多 通孔而柱压很低，由于对流传质而传质阻力很小，非常适合用于样品预处 理。本实施例制备了带磷酸基团的聚合物整体毛细管柱并将其用于磷酸肽 的富集。1) 毛细管预处理首先用0.1M NaOH溶液冲洗毛细管空柱1 h,再用去离子水冲洗毛细 管至流出液体pH值为7.0,然后用甲醇溶液冲洗毛细管柱10min,用氮气吹 干。往毛细管中注入甲醇与甲基丙烯酰氧丙基一三甲氧基硅烷的混合物。 在20度至70度温度下反应5—24小时。然后用甲醇及水冲洗。最后用氮 气欢干待用。2) 聚合物整体柱的制备以2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯为功能单体，亚甲基双丙烯酰胺 为交联剂，十二醇，二甲基亚砜和N,N-二甲基甲酰胺为致孔剂，单体、交 联剂、致孔剂按质量百分比分别为13%、 10%和77%均匀混合，所加引发 剂的用量为聚合物单体用量的1%，将混合液用超声振荡15min后，将反应 液吸入已经预处理过的空毛细管中，将毛细管的两端用橡胶小塞封口并浸 于6(TC水浴中反应8-24h。反应完成后，以甲醇为流动相，用液相色谱泵 冲洗毛细管柱约2h，去除床层内的致孔剂、残留反应试剂以及反应产生的 一些低聚合度物质；如图1所示，单体、引发剂及致孔剂在反应开始前构成稳定的均相反应体系，当温度升高到一定值时，引发剂分解产生自由基引发聚合反应。 当反应进行到一定的程度时，聚合物链从溶液中沉降出来形成稳定的分散体系，经进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法，其特征在于：采用带有烯键和磷酸基团的化合物单体，进行聚合反应，形成磷酸基团聚合物，该材料经与锆离子作用后生成磷酸酯锆基团，可用于富集磷酸化肽段等带有磷酸基团的化合物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邹汉法，董靖，叶明亮，周厚江，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]