Ca制造技术

本发明专利技术公开了一种Ca

【技术实现步骤摘要】
Ca2+在提高CELI家族酶活性中的应用
本专利技术涉及Ca2+在提高CELI家族酶活性中的应用，属于生物

技术介绍
CELI酶是一种单链、双链都特异识别的特异性核酸酶，等电点为6.0-6.5，分子量大小为43kDa(Yangetal,1999)；CELI酶和CELII酶都具有识别碱基错配的能力，其同源性为49％(见图5)(Yangetal,1999；Pimkinetal,2006)。传统理论认为该酶的催化活性只需要Mg2+和Zn2+(Tilletal,2004)，它可以识别八种错配形式的碱基(mismatches)分别为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowskietal,1999；Oleykowskietal,1998)，因此被广泛应用于突变检测领域，如植物TILLING技术平台中(Tilletal,2006)。该酶可以特异性切割错配碱基(BingYangetal,1999)。通过酶切扩增的目标检测片段并经琼脂糖或毛细管电泳分离检测，一般可方便获得突变位置和大小。因此，它是一种比较方便和经济的检测未知和已知突变位点的手段(Yeungetal,2005)。目前CELI酶主要提取途径是从芹菜中提取，主要提取方法是通过硫酸铵沉淀法，得到粗提酶液(Tilletal,2006)。如果需要得到纯度更高的酶，需要经过刀豆体蛋白A-琼脂糖柱吸附，用alpha-甘露糖苷洗脱，但是得率较低(Yangetal,1999)。因此，大部分TILLING突变体检测实验是用粗提酶来检测的，该粗提酶的主要成分即为CELI(Yangetal,1999；Tilletal,2006)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供Ca2+的新用途。本专利技术提供了Ca2+在促进CELI酶活性中的应用。上述应用中，所述CELI酶活性为切割错配位点。本专利技术还提供了Ca2+在制备CELI酶酶切缓冲液或CELI酶酶切缓冲体系中的应用。本专利技术的另一个目的是提供含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液。本专利技术提供的含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液中，所述Ca2+在所述CELI酶酶切缓冲液中的浓度为0.5-50mM。上述含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液中，所述Ca2+在所述CELI酶酶切缓冲液中的浓度具体为0.5mM、5mM、10mM、15mM、30mM或50mM；上述含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液中，所述含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液由Ca2+、BSA、TritonX-100、KCl和HEPES缓冲液组成；所述HEPES缓冲液为浓度为0.1M、pH值为7.5的HEPES缓冲液。本专利技术还有一个目的是提供一种酶切反应体系。本专利技术提供的酶切反应体系包括上述含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液和CELI酶。本专利技术还有一个目的是提供一种CELI酶试剂盒。本专利技术提供的CELI酶试剂盒为如下(1)或(2)：(1)上述酶切缓冲液；(2)上述酶切缓冲液和CELI酶。上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在促进CELI酶切割含有错配位点DNA中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在检测待测DNA分子是否含有错配位点中的应用也属于本专利技术的应用。本专利技术的最后一个目的是提供一种用CELI酶酶切含有错配位点DNA的方法。本专利技术提供的用CELI酶酶切含有错配位点DNA的方法包括如下步骤：将含有错配位点DNA和野生型DNA在上述酶切反应体系中进行酶切反应，实现酶切；所述含有错配位点DNA和野生型DNA的质量比为1：(1-24)。上述方法中，所述含有错配位点DNA和野生型DNA的质量比为1:(12-24)。上述应用或方法中，所述错配位点的错配形式为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和/或TT。上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒或上述方法在低丰度未知突变体检测中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术发现了新的催化活性物质Ca2+，通过实验证明：Ca2+可以进一步提高CELI酶活，特别是对低丰度突变的检测。比传统的酶切方法相比，本专利技术的方法更为灵敏，Ca2+的终浓度在0.5-50mM范围内都可以提高CELI酶的检测灵敏度，对低丰度未知突变体的检测，如某癌症基因都有很好的检测效果，特别是TILLING技术平台检测诱变群体时，有明显优势，不仅仅简化了PCR纯化步骤，同时相应地提高了检测分辨率。附图说明图1为Ca2+对CELI酶切效果。图2为Ca2+对CELI酶切效果。图3为Ca2+对CELI酶切效果。图4为Ca2+和Mg2+对CELI酶切效果。图5为CELI与CELII同源关系比较图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。MutationDetectionKit-S100试剂盒是美国环球基因公司的产品，产品目录号为706025。BindingBuffer是美国zymoresearch公司的产品；DNAClean&ConcentratorTM-25。实施例1、Ca2+在提高CELI酶活性中的应用一、待酶切DNA样品的制备1、DNA的合成人工合成序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNAa0(浓度为1ng/ul)；序列2为将序列1的第544位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNAa1(浓度为1ng/ul)；序列4为将序列3的第503位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列5所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNAa2(浓度为1ng/ul)；序列5为将序列3的第389位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNAa3(浓度为1ng/ul)；序列6为将序列3的第563位核苷酸由C突变为A后得到的DNA分子。人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列7所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNAa4(浓度为1ng/ul)；序列7为将序列3的第495位核苷酸由T突变为C后得到的DNA分子。2、PCR扩增分别以上述待PCR扩增的DNAa0、待PCR扩增的DNAa1、待PCR扩增的DNAa2、待PCR扩增的DNAa3、待PCR扩增的DNAa4为模板，采用F和R引物对所述模板进行PCR扩增，扩增至45个热循环，然后进行99℃变性10min，降温至70℃，每个循环降低0.3℃，69个循环结束，分别得到PCR扩增产物a0即待酶切DNA样品a0、PCR扩增产物a1即待酶切DNA样品a1、PCR扩增产物a2即待酶切DNA样品a2、PCR扩增产物a3即待酶切DNA样品a3、PCR扩增产物a4即待酶切DNA样品a4。待扩增完毕后，用1％琼脂糖凝胶检测，检测条带是否特异，条带本文档来自技高网...

【技术保护点】
Ca

【技术特征摘要】
1.Ca2+在促进CELI酶活性中的应用；或Ca2+在制备CELI酶酶切缓冲液或CELI酶酶切缓冲体系中的应用。2.含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液，其特征在于：所述Ca2+在所述CELI酶酶切缓冲液中的浓度为0.5-50mM。3.一种酶切反应体系，包括权利要求2所述的含有Ca2+的CELI酶酶切缓冲液和CELI酶。4.一种CELI酶试剂盒，为如下(1)或(2)：(1)权利要求2所述的酶切缓冲液；(2)权利要求2所述的酶切缓冲液和CELI酶。5.权利要求2所述的酶切缓冲液或权利要求3所述的酶切反应体系或权利要求4所述的试剂盒在促进CELI酶切割含有错配位点DNA中的应用。6.权利要求2所述的酶切缓冲液或权利要求3所述的酶切反应体系或权利要求4所述的试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春明，姚学峰，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11