一种针对尿路上皮癌的尿脱落肿瘤细胞微流控芯片检测技术制造技术

本发明专利技术属于生物体液体外检测领域，具体涉及一种针对尿路上皮癌的尿脱落肿瘤细胞微流控芯片检测技术。本发明专利技术微流控芯片包括依次连接的样本入口、细胞捕获区域以及样本出口，所述细胞捕获区域设有多个细胞分选器，所述细胞分选器由三个整体呈弧形排布的柱状凸起构成，柱状凸起之间存在间隙，弧形开口作为液流入口，中间柱状凸起两侧的间隙作为液流出口，两个液流出口呈对称分布。本发明专利技术实现了尿液中各类细胞的分离捕获、并可兼容多种下游细胞学染色方法以实现细胞识别，提高了人尿液中的尿脱落肿瘤细胞的检测准确度，摆脱了常规方法对于病理医生主观经验的依赖，且全程无创。此外，其无损的细胞捕获、回收方式为下游的分子生物学分析奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种针对尿路上皮癌的尿脱落肿瘤细胞微流控芯片检测技术
本专利技术属于生物体液体外检测领域，具体涉及一种针对尿路上皮癌的尿脱落肿瘤细胞微流控芯片检测技术。
技术介绍
1、临床现役技术-尿脱落细胞学检查：尿脱落细胞学检查(Cytology)是目前临床上普遍使用的尿路上皮癌检测方法。为寻找肿瘤细胞，该方法依赖病理医生对涂片进行主观观察(针对细胞的细胞核、染色质、胞浆等因素对细胞进行判断)，主要有以下缺点：(1)检测敏感度低，一般只有30-50％。(2)阅片完全依赖于病理医生的主观经验，不同病理医生之间的判断结果或不一致。(3)染色过程繁琐，人工参与度大、工作强度大。细胞染色效果受人员经验、熟练度的影响。2、临床现役技术-膀胱镜、输尿管软镜检查膀胱镜、输尿管软镜检查是目前临床诊断尿路上皮癌的金标准。其通过导管将窥镜经尿道传送至目标区域，对可疑占位进行成像、观察。但仍具有如下缺陷：(1)属于侵入式检查，患者所承受的痛苦大；(2)肿瘤发展到肉眼可见时才能被观察到，不利于早期诊断.3、其他在研技术-基于微滤膜的尿液细胞检查为克服传统尿脱落细胞学检查敏感度低的缺点，一些研究组使用微滤膜来检测尿脱落肿瘤细胞。相较于传统尿脱落细胞学检查，该方法利用滤膜过滤的原理捕获尿脱落细胞，敏感度略有提升，但仍具有以下缺陷：(1)捕获到细胞后，仍仅采用传统的病理学染色方法(巴氏染色)，该方法如同临床现役的尿脱落细胞学检查，高度依赖病理科医生，受主观因素的制约；(2)该滤膜的滤孔口径单一，为7.5um；然而尿路上皮癌患者尿液中的细胞成分复杂，除了肿瘤细胞，还有正常脱落的尿路上皮细胞、白细胞、红细胞等，这些细胞尺寸均不一致，若使用单一孔径，仍将导致视野中细胞成分混乱，干扰后续的判断分析；(3)无法对细胞的捕获过程进行实时成像、监测、调控，例如：(a)在细胞量过剩导致滤膜堵塞的情况下，无法及时终止进程；(b)在流速过高导致细胞破损严重的情况下，无法实时控制流速；(4)受最大载荷量的限制，当细胞数量过高，所有滤孔均被占据,该滤膜随即失效；随后而来的细胞将全部堵塞于滤膜，导致视野混乱，难以进行下一步细胞层面的判读。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种针对尿路上皮癌的尿脱落肿瘤细胞微流控芯片检测技术。为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供了一种微流控芯片，包括依次连接的样本入口、细胞捕获区域以及样本出口，所述细胞捕获区域设有多个细胞分选器，所述细胞分选器由三个整体呈弧形排布的柱状凸起构成，柱状凸起之间存在间隙，弧形开口作为液流入口，中间柱状凸起两侧的间隙作为液流出口，两个液流出口呈对称分布。优选地，所述细胞捕获区域设有三种不同尺寸规格的细胞分选器，分别为第一尺寸细胞分选器、第二尺寸细胞分选器和第三尺寸细胞分选器，所述第一尺寸细胞分选器、第二尺寸细胞分选器和第三尺寸细胞分选器的尺寸依次减小。优选地，相邻的细胞分选器尺寸不同。优选地，所述微流控芯片包括多个细胞分选单元，每个所述细胞分选单元由一个第一尺寸细胞分选器、一个第二尺寸细胞分选器和一个第三尺寸细胞分选器组成。优选地，位于同一行的细胞分选单元中各尺寸细胞分选器的排布方式相同。优选地，横向相邻的细胞分选器，边距相同。优选地，横向依次等边距排列的一个第一尺寸细胞分选器、一个第二尺寸细胞分选器和一个第三尺寸细胞分选器组成一个第一细胞分选单元；横向依次等边距排列的一个第一尺寸细胞分选器、一个第三尺寸细胞分选器和一个第二尺寸细胞分选器组成一个第二细胞分选单元；多个第一细胞分选单元横向循环排布构成第一细胞分选阵列，多个第二细胞分选单元横向循环排布构成第二细胞分选阵列，相互平行的一个第一细胞分选阵列和一个第二捕获阵列组成一个细胞分选二级阵列，细胞捕获区域中多个相互平行的细胞分选二级阵列纵向等边距循环排布。优选地，在每个细胞分选二级阵列中，第二细胞分选阵列的第一尺寸细胞分选器的液流入口的中点与对应第一细胞分选阵列的第三尺寸细胞分选器和第二尺寸细胞分选器横向边距的中点对齐。优选地，各奇数行细胞分选二级阵列的首行首列细胞分选器纵向位置对齐；各偶数行细胞分选二级阵列较相邻的前一奇数行细胞分选二级阵列向右侧等距偏移。优选地，第一尺寸细胞分选器的液流入口的宽度为60±5μm，液流出口的宽度为22±5μm；第二尺寸细胞分选器的液流入口的宽度为30±3μm，液流出口的宽度为10±3μm；第三尺寸细胞分选器的液流入口的宽度为16μ±1m，液流出口的宽度为4±1μm。本专利技术的第二方面，提供前述微流控芯片的制备方法，包括：按照聚二甲基硅氧烷标准工艺，采用常规载玻片作为基底，通过等离子处理键合，制备获得微流控芯片。本专利技术的第三方面，提供了前述微流控芯片用于捕获或回收尿脱落细胞的用途。优选地，所述尿脱落细胞中含有尿脱落肿瘤细胞。优选地，所述尿脱落细胞中含有尿路上皮癌细胞。所述上皮癌包括膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌。本专利技术的第四方面，提供了一种捕获或回收尿脱落细胞的方法，包括步骤：将待处理的尿液样本或者尿沉渣的悬浮液，通入本专利技术的微流控芯片。优选地，所述尿脱落细胞中含有尿脱落肿瘤细胞。优选地，所述尿脱落细胞中含有尿路上皮癌细胞。所述上皮癌包括膀胱癌、输尿管癌、肾盂癌。本专利技术的第五方面，提供一种巴氏染色方法，包括步骤：先用本专利技术的微流控芯片捕获和分选尿脱落细胞，然后将捕获的尿脱落细胞进行巴氏染色。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：针对目前尿路上皮癌临床诊断中存在的敏感度低、依赖病理医生的主观判断、有创、低效等问题，本专利技术所提供的微流控芯片可依据物理尺寸差异实现人尿液中各类细胞的分离捕获、并可兼容多种下游细胞学染色方法以实现细胞识别。该技术提高了人尿液中的尿脱落肿瘤细胞的检测准确度，摆脱了常规方法对于病理医生主观经验的依赖，且全程无创。此外，其无损的细胞捕获、回收方式为下游的分子生物学分析奠定了基础。附图说明图1：微流控芯片结构及基本原理示意图。图2：细胞分选器的结构示意图。图3：不同尺寸的细胞分选器依据细胞尺寸差异分级捕获细胞原理示意图。图4：微流控芯片细胞捕获区中细胞分选单元示意图。图5：微流控芯片细胞捕获区中细胞捕获阵列示意图。图6：本专利技术微流控芯片捕获到的尿脱落细胞，比例尺：20μm。图7：微流控芯片捕获到的尿脱落肿瘤细胞的免疫荧光图像：DAPI+、CK20+、CD44v6+。图8：尿路上皮癌尿脱落细胞微流检测技术所得的ROC曲线。图9：经巴氏染色后的细胞：(a-b)细胞团(c)核异型(d)细胞异型(e)高核质比(f)正常尿路上皮细胞(比例尺：20μm)。图10：利用本专利技术微流控芯片捕获、回收的6个尿脱落细胞进行单细胞测序，并分析其CNV情况。元件标号说明1-1样本入口1-2细胞捕获区域1-3样本出口2细胞分选器201柱状凸起202液流入口203液流出口2-1第一尺寸细胞分选器2-2第二尺寸细胞分选器2-3第三尺寸细胞分选器3细胞分选单元3-1第一细胞分选单元3-2第二细胞分选单元4细胞分选二级阵列4-1第一细胞分选阵列4-2第二细胞分选阵列具体实施方式一、微流控芯片本专利技术的微流控芯片的结构及原理示意图可参见图1。具体地，所述微流控芯片，包括沿液流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流控芯片，包括依次连接的样本入口、细胞捕获区域以及样本出口，所述细胞捕获区域设有多个细胞分选器，所述细胞分选器由三个整体呈弧形排布的柱状凸起构成，柱状凸起之间存在间隙，弧形开口作为液流入口，中间柱状凸起两侧的间隙作为液流出口，两个液流出口呈对称分布。

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，包括依次连接的样本入口、细胞捕获区域以及样本出口，所述细胞捕获区域设有多个细胞分选器，所述细胞分选器由三个整体呈弧形排布的柱状凸起构成，柱状凸起之间存在间隙，弧形开口作为液流入口，中间柱状凸起两侧的间隙作为液流出口，两个液流出口呈对称分布。2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞捕获区域设有三种不同尺寸规格的细胞分选器，分别为第一尺寸细胞分选器、第二尺寸细胞分选器和第三尺寸细胞分选器，所述第一尺寸细胞分选器、第二尺寸细胞分选器和第三尺寸细胞分选器的尺寸依次减小。3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，相邻的细胞分选器尺寸不同。4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括多个细胞分选单元，每个所述细胞分选单元由一个第一尺寸细胞分选器、一个第二尺寸细胞分选器和一个第三尺寸细胞分选器组成。5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，位于同一行的细胞分选单元中各尺寸细胞分选器的排布方式相同。6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，横向相邻的细胞分选器，边距相同。7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于，横向依次等边距排列的一个第一尺寸细胞分选器、一个第二尺寸细胞分选器和一个第三尺寸细胞分选器组成一个第一细胞分选单元；横向依次等边距排列的一个第一尺寸细胞分选器、一个第三尺寸细胞分选器和一个第二尺寸细胞分选器组成一个第二细胞分选单元；多个第一细胞分选单元横向循环排布构成第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：金百冶，韩平畴，傅广候，陈安琪，
申请(专利权)人：浙江大学，北京大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33