一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法。本发明专利技术先用DNS法测出富含还原糖的蛋白样品中还原糖的浓度，再通过还原糖与BCA试剂反应的等比关系计算出在利用BCA试剂测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量时扣除还原糖的贡献值，最后利用蛋白质与BCA试剂反应的等比关系计算出蛋白质的准确含量。本发明专利技术所述方法能排除富含还原糖的蛋白样品中还原糖的干扰，快速、精确的测定出富含还原糖的蛋白样品中蛋白质的含量。

【技术实现步骤摘要】
一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法
本专利技术涉及蛋白质检测领域，具体为一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法。
技术介绍
蛋白含量是生物样品品质的重要特征参数之一，如烟叶蛋白含量高，表明其商品品质较低，奶粉中蛋白含量决定其营养品质。此外，某些病理情况下体液标本如糖尿中血红蛋白定量检测能够直观反映血糖控制效果，对糖尿病患者的临床检查和治疗具有重要意义。二喹啉甲酸(BCA)法是广为应用的蛋白定量方法。其原理是在强碱性条件下，蛋白质分子中的肽键结构首先与硫酸铜电离出的二价铜离子发生络合反应生成络合物，将Cu2+还原成Cu+，然后BCA工作液特异性的与Cu+结合生成紫红色的稳定复合物，这种稳定复合物在λ＝562nm附近处有最大吸光度，故可根据颜色的吸光度来计算蛋白质的含量。BCA法操作简便、灵敏度高(20-2000ug/L)、快速(约40min)、试剂稳定性好、测定结果准确、经济适用，对不同蛋白质着色力一致，并且具有抗干扰能力强的优势，低于一定浓度的缓冲盐、表面活性剂及螯合剂等干扰物质均对BCA法定量蛋白无影响。然而，BCA反应试剂最初用于还原糖的测定，因此，采用BCA法测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量时必定受还原糖的干扰，故采用BCA法测定蛋白含量时需样品中的葡萄糖等还原糖的含量控制在500mg/L以下，无法准确定量检测富含还原糖的蛋白样品中的蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法，通过排除蛋白样品中还原糖的干扰，能快速、精确的测定出富含还原糖的蛋白样品中蛋白的含量，对鉴定样品品质、临床检查和治疗具有重大意义。本专利技术的技术方案是：测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法，具有以下步骤，1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备牛血清蛋白标准曲线；2)将富含还原糖的蛋白样品研磨、离心，取上清液定容，得到富含还原糖的蛋白样品液；3)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用DNS法测定样品中还原糖的OD值，记为OD1，将OD1代入步骤1)DNS法制备葡萄糖标准曲线中，得到步骤2)所得蛋白样品液中还原糖的浓度，记为C1；4)将步骤3)所得C1代入步骤1)BCA法制备葡萄糖标准曲线中，得到对应的OD值，记为OD2；5)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用BCA法测定样品中还原糖+蛋白质的OD值，记为OD3；6)步骤5)所得OD3减去步骤4)所得OD2，得OD4，将OD4代入步骤1)BCA法制备牛血清蛋白标准曲线中，得到步骤2)所得蛋白样品液中蛋白质的浓度，记为C2，C2与步骤2)定容体积相乘得到富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量。步骤2)中所述研磨是将富含还原糖的样品与pH＝7的磷酸缓冲液在研钵中混合后研磨，所述离心的转速为12000r/min，取上清液。步骤1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线的步骤为，1)分别配置浓度为0mg/ml、0.48mg/ml、0.56mg/ml、0.64mg/ml、0.72mg/ml的葡萄糖标准溶液；2)按5体积份葡萄糖标准溶液混合4体积份DNS反应试剂的比例添加DNS反应试剂混匀,混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；3)步骤2)各定容后的葡萄糖标准溶液在UV波长540nm测定，得到对应吸光值；4)以各葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，各葡萄糖标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到葡萄糖标准曲线。步骤1)采用BCA法制备葡萄糖标准曲线的步骤为，1)分别配置浓度为0mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的葡萄糖标准溶液；2)按5体积份葡萄糖标准溶液混合4体积份BCA反应试剂的比例添加BCA反应试剂混匀,混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；3)步骤2)各定容后的葡萄糖标准溶液在UV波长562nm测定，得到对应吸光值；4)以各葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，各葡萄糖标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到葡萄糖标准曲线。步骤1)采用BCA法制备牛血清蛋白标准曲线的步骤为，1)分别配置浓度为0mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、1mg/ml的蛋白标准溶液；2)按5体积份牛血清标准溶液混合4体积份BCA反应试剂的比例添加BCA反应试剂混匀，混匀后，沸水浴5min，快速冷却，用蒸馏水定容；3)步骤2)各定容后的蛋白标准溶液在UV波长562nm测定，得到对应吸光值；4)以各蛋白标准溶液浓度为横坐标，各蛋白标准溶液吸光值为纵坐标，制备得到蛋白标准曲线。本专利技术测定方法先用DNS法测定富含还原糖的蛋白样品中还原糖的浓度，测得的还原糖OD值为富含还原糖的蛋白样品中还原糖的准确OD值，代入DNS法制备葡萄糖标准曲线得出的浓度为富含还原糖的蛋白样品中还原糖的准确浓度。再将得到的还原糖的准确浓度代入BCA法制备的葡萄糖标准曲线中，换算得到的OD值为富含还原糖的蛋白样品采用BCA法测定的OD值中还原糖的OD值。最后，采用BCA法测定富含还原糖的蛋白样品时，BCA反应试剂与还原糖、蛋白均着色，得出的OD值减去BCA法测蛋白时应该扣除的还原糖OD贡献值，即得出富含还原糖的蛋白样品采用BCA法测蛋白质的OD值，代入BCA法制备的蛋白标准曲线中，即可得出富含还原糖的蛋白样品中蛋白质的准确浓度。采用上述技术方案可以实现以下有益效果：通过排除富含还原糖的蛋白样品中还原糖的干扰，实现对富含还原糖的蛋白样品中蛋白质浓度测定，经申请人实验验证，采用本专利技术所述方法能快速、准确定量检测富含还原糖的蛋白样品(烟叶、苹果果肉、糖尿)中蛋白的含量，实现对送检样品品质鉴定、临床检查等目的。本专利技术使用的试剂普通、易得，操作步骤简单、快捷，对设备要求标准底，适用于各级质检站、医院等对富含还原糖的蛋白样品进行蛋白含量测定。附图说明图1为采用DNS法制备的葡萄糖标准曲线；图2为采用BCA法制备的葡萄糖标准曲线；图3为采用BCA法制备的牛血清蛋白标准曲线。具体实施方式本专利技术使用的试剂如下：牛血清蛋白为市售产品，纯度为98％；葡萄糖为市售分析纯；pH＝7磷酸缓冲液浓度为0.05mol/L，配置方法如下，取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)配置浓度为0.05mol/L的磷酸氢二钠溶液，取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)配合浓度为0.05mol/L磷酸二氢钠溶液；取上述磷酸氢二钠溶液61ml、磷酸二氢钠溶液39ml，混合均匀后用pH计测量，pH不足7.0的添加适量的磷酸氢二钠，反之加入一定量的磷酸二氢钠溶液，直到混合后的缓冲液pH＝7.0为止。DNS反应试剂：称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500ml蒸馏水中，加热(不超过50℃)，于热溶液中依次加入3，5二硝基水杨酸6.3g，NaOH21.0g，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，贮存于棕色瓶中，室温保存。BCA反应试剂：A液100ml：准确称取1gBCA二钠、2gNa2CO3、0.16g酒石酸钠、0.4gNaOH、0.95NaHCO3，用适量的蒸馏水充分溶解后，用6mol/LNaOH溶液将pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法，其特征在于，具有以下步骤，1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备牛血清蛋白标准曲线；2)将富含还原糖的蛋白样品研磨、离心，取上清液定容，得到富含还原糖的蛋白样品液；3)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用DNS法测定样品中还原糖的OD值，记为OD

【技术特征摘要】
1.一种测定富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量的方法，其特征在于，具有以下步骤，1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备葡萄糖标准曲线，采用BCA法制备牛血清蛋白标准曲线；2)将富含还原糖的蛋白样品研磨、离心，取上清液定容，得到富含还原糖的蛋白样品液；3)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用DNS法测定样品中还原糖的OD值，记为OD1，将OD1代入步骤1)DNS法制备葡萄糖标准曲线中，得到步骤2)所得蛋白样品液中还原糖的浓度，记为C1；4)将步骤3)所得C1代入步骤1)BCA法制备葡萄糖标准曲线中，得到对应的OD值，记为OD2；5)在步骤2)所得蛋白样品液中取样，采用BCA法测定样品中还原糖+蛋白质的OD值，记为OD3；6)步骤5)所得OD3减去步骤4)所得OD2，得OD4，将OD4代入步骤1)BCA法制备牛血清蛋白标准曲线中，得到步骤2)所得蛋白样品液中蛋白质的浓度，记为C2，C2与步骤2)定容体积相乘得到富含还原糖的蛋白样品中蛋白质含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述研磨是将富含还原糖的蛋白样品与pH＝7的磷酸缓冲液在研钵中混合后研磨，所述离心的转速为12000r/min，取上清液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)采用DNS法制备葡萄糖标准曲线的步骤为：1)分别配置浓度为0mg/ml、0.48mg/ml、0.56mg/ml、0.64mg/ml、0.72mg/ml的葡萄糖标准溶液；2)按5体积份葡萄糖标准溶液混合4体积份DNS反应试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：王万能，
申请(专利权)人：重庆理工大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50