一种光动力疗法辅助手术治疗小鼠乳腺癌细胞的试验方法技术

一种光动力疗法辅助手术治疗小鼠乳腺癌细胞的试验方法，步骤如下：荧光纳米粒子溶液的制备；小鼠乳腺癌细胞培养；实验方法是：将六周龄小鼠进行腋下接种小鼠乳腺癌细胞；2周后，将小鼠分为对照组、单纯手术切除组、单纯光动力组和手术切除联合光动力组；手术联合光动力杀伤残余肿瘤：术前12小时将制备好的荧光纳米粒子溶液尾静脉注射入各组小鼠体内，然后利用白光进行照射15分钟，然后分别进行肿瘤大小的监控；在确定实验组肿瘤消失之后，各组小鼠背部再次接种同种肿瘤细胞，继续监测后续接种的肿瘤发展。本发明专利技术的优点是：该方法联合具有聚集诱导发光性质的光敏剂和手术切除，解决了传统方法不能根除的局限、治疗慢、术后复发的缺点。

A test for photodynamic therapy for breast cancer cells

Step test method, a kind of adjuvant photodynamic therapy of murine breast cancer cells as follows: fluorescent nanoparticles solution preparation; mouse breast cancer cell culture; experiment method: six week old mice were inoculated with mouse breast cancer cells; after 2 weeks, the rats were divided into control group, simple excision group simple, PDT group and surgical resection combined with photodynamic therapy group; surgery combined with Photodynamic Killing residual tumor: 12 hours before the operation the prepared solution of the fluorescent nanoparticles intravenously injected into mice, then the Bai Guangjin radiation 15 minutes, then respectively for monitoring tumor size; after determining the tumor disappeared, mice the back of the second inoculation of the same tumor cells, continue to monitor the follow-up inoculation of tumor development. The method has the advantages that the method combines the photosensitizer and the surgical resection with the aggregation inducing light property, and solves the limitation that the traditional method can not be eradicated, and has the disadvantages of slow treatment and postoperative recurrence.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及辅助手术治疗癌细胞，特别是一种光动力疗法辅助手术治疗小鼠乳腺癌细胞的试验方法。
技术介绍
癌症具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征，其发生是一个多因子、多步骤的复杂过程。外科手术过程中，外科手术主要依据肉眼观察组织的色泽、形态、触质地等判断肿瘤切除的范围和切缘。若是以手术完全移除肿瘤细胞，癌症是可以被治愈的且疗效直接迅速。对早期或较早期实体肿瘤来说，手术切除仍然是首选的治疗方法。但如果一些肿瘤由于肿瘤浸润和周围结构异常，常常导致意外损伤或肿瘤残余，甚至不能识别，因此不能彻底的消灭癌细胞，在一定的时间内癌细胞还会再长。因此，如何准确地识别肉眼难以识别的肿瘤及其边缘，精确手术切除肿瘤病灶，最大程度地保留正常组织，成为现代外科需要解决的重要技术问题。聚乙二醇(PEG)具有很强的吸水性，在常温条件下可从空气中吸收水分，液体可与水任意比例混溶，当温度升高后，任何级分的固体聚乙二醇均能与水任意比例互溶，当温度高至水的沸点是，聚合物会沉淀出来，析出温度取决于聚合物的分子量和浓度。聚乙二醇(PEG)属非离子型聚合物，在正常条件下是稳定的，作为一种两亲性聚合物，既可溶于水，又可溶于绝大多数的有机溶剂，且具有生物相容性好、无毒、免疫原性低等特点，可通过肾排出体外，在体内不会有积累。荧光纳米粒子是指与蛋白质或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变的小分子物质。可用于研究大分子物质的性质和行为。可以发荧光的半导体纳米微晶体(量子点)或将荧光团通过包埋、共价键连接以及超分子组装等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能。与传统的荧光染料相比，荧光纳米粒子具有更高的亮度和光稳定性，也能更加容易地实现水分散性和生物相容性。另外，随着纳米制备技术的进一步提高，对纳米粒子的尺度的精确控制及对粒子功能化手段的日臻完善，这在很大程度上使荧光纳米粒子满足了化学传感器、生物探针等领域的要求。而且纳米粒子作为新一类的荧光标记材料已经逐步发展到活体细胞成像中。将纳米粒子直接用于生物检测主要优势是利用纳米粒子的高荧光稳定性，可以在几十分钟到数小时研究细胞的过程中进行实时跟踪检测。近年来研究发现，650-900纳米的近红外光与可见光相比可穿透更深层的组织，而且在此光谱范围内近红外光的自体荧光较小。因此，肿瘤组织被包有光敏剂(近红外荧光纳米探针)的纳米粒子标记后，当近红外激发光照射时，肿瘤组织就会发出近红外荧光，从而有效地显示肿瘤及其边缘，再通过活体成像仪对小鼠肿瘤部位进行切除。光动力疗法(PhotodynamicTherapy，PDT)是利用光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种新技术。其作用基础是光动力效应。这是一种有氧分子参与的伴随生物效应的光敏化反应。其过程是，特定波长的激光照射使组织吸收的光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。此外，在光动力治疗中，除了光能转化过程中产生的单态氧和自由基能直接杀伤病变细胞外，还因这一过程引发的毛细血管内皮损和血管栓塞造成的局部微循环障碍，进一步导致病变组织的缺血性坏死。光动力疗法原理是先将光敏剂注入病变部位，然后用特定波段激光照射患病区域。光敏剂激活后产生光动力反应并导致病变部位出现光性过程，产生活性氧如单线态氧等杀死异常增生的细胞，而邻近组织则不受任何影响。肿瘤对手术切除没有生物抵抗性，同时手术没有潜在的致癌效果。手术能治疗很大一部分没有扩散的癌症。手术治疗亦有其不足之处。切除术对恶性组织并无特异性，亦即正常组织和肿瘤组织同样受到破坏，外科切除对已经扩散超过局部或区域的肿瘤是不能治愈的。而由于光动力学疗法对靶组织及损伤程度都具有可选择性，攻击目标是光照区的病变组织，对病灶周边的正常组织损伤轻微，可减少对正常组织的损伤。此外，毒性低，进入组织的光动力疗法的药物，只有达到一定浓度并受到足量光辐照，才会引发光动力反应杀伤细胞，未受到光辐照的部分，并不产生光动力反应，体内造血功能也不会受到影响。因此在癌症等治疗过程中，应联合手术切除和光动力疗法，进行综合治疗。本专利技术希望将光敏剂(具有聚集诱导发光效应)包裹于聚乙二醇中形成一种新型荧光纳米粒子，这种纳米粒子可以富集在肿瘤细胞部位，在近红外激光照射条件下，可以发出较强的荧光，定位肿瘤组织及边缘，并通过手术实时切除肿瘤，最大程度地保留正常组织(指导手术)。同时，这种纳米粒子可以在近红外激光照射条件下，可以产生活性氧物质(ROS),如单线态氧等，对肿瘤细胞(包括不能被肉眼识别的异常增生的细胞)进行直接杀伤，而邻近组织则不受任何影响(杀死残留细胞)。此外，在纳米粒子活性氧物质(ROS)对肿瘤细胞的杀伤过程中，招募大量的淋巴细胞浸润，产生急性炎症反应，暴露大量的肿瘤抗原，促进抗原提呈细胞的对肿瘤抗原的摄取和提呈，最终募集大量的CD8+T淋巴细胞到残余肿瘤部位，进一步对残余肿瘤进行歼灭，并且能够产生特异性的免疫记忆淋巴细胞，防止同种肿瘤细胞复发。(免疫记忆)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述存在问题和技术分析，提供一种光动力疗法辅助手术治疗小鼠乳腺癌细胞的试验方法，该方法联合具有聚集诱导发光性质的光敏剂和手术切除，解决了传统方法不能根除的局限、治疗慢、术后复发的缺点。本专利技术的技术方案：一种光动力疗法辅助手术治疗小鼠乳腺癌细胞的试验方法，步骤如下：1.荧光纳米粒子溶液的制备将聚乙二醇4毫克和具有聚集诱导发光性质的光敏剂TPE-DCM1毫克溶于1毫升四氢呋喃(THF)中，在超声破碎仪中将这1毫升溶液缓慢逐滴地加入9毫升的超纯水中制成10毫升纳米溶液体系，之后将溶液中的四氢呋喃(THF)吹掉，得到澄清的荧光纳米粒子溶液；2.小鼠乳腺癌细胞培养将处于对数生长期的肿瘤细胞经胰酶消化后，用pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液(pH＝7.4)洗涤一次，用无血清的培养基重悬细胞；在37℃、含5％的二氧化碳的一个潮湿的环境中，将小鼠乳腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素的DMEM培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)中。3实验方法1)接种将六周龄小鼠进行腋下接种小鼠乳腺癌细胞(LUC-4T1)，每只接种50万细胞，当肿瘤达到200–400mm3，小鼠被用于活体成像研究；2)分组2周后，将小鼠分为4组，分别为对照组、单纯手术切除组、单纯光动力组和手术切除联合光动力组，每组5只；3)手术联合光动力杀伤残余肿瘤术前12小时将制备好的荧光纳米粒子溶液尾静脉注射入各组小鼠体内，各组小鼠体的实施方法是：假手术对照组，暴露肿瘤之后不手术，不光照；单纯手术组，只手术切除3/4的肿瘤组织；单纯光动力组，暴露肿瘤之后不手术，直接光照15分钟；手术联合光动力组，手术切除3/4的肿瘤组织；然后利用白光进行照射15分钟，然后分别进行肿瘤大小的监控；4)背部再次接种同种肿瘤细胞在确定实验组肿瘤消失之后，各组小鼠背部再次接种同种肿瘤细胞，继续监测后续接种的肿瘤发展。本专利技术的优点是：1)配合手术实施光动力治疗的过程，术前静脉注射荧光纳米粒子，在荧光成像本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光动力疗法辅助手术治疗小鼠乳腺癌细胞的试验方法，步骤如下：（1）荧光纳米粒子溶液的制备将聚乙二醇4毫克和具有聚集诱导发光性质的光敏剂TPE‑DCM1毫克溶于1毫升四氢呋喃(THF)中，在超声破碎仪中将这1毫升溶液缓慢逐滴地加入9毫升的超纯水中制成10毫升纳米溶液体系，之后将溶液中的四氢呋喃(THF)吹掉，得到澄清的荧光纳米粒子溶液；（2）小鼠乳腺癌细胞培养将处于对数生长期的肿瘤细胞经胰酶消化后，用pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液洗涤一次，用无血清的培养基重悬细胞；在37℃、含5％的二氧化碳的一个潮湿的环境中，将小鼠乳腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素的DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)中。（3）实验方法1)接种将六周龄小鼠进行腋下接种小鼠乳腺癌细胞(LUC‑4T1)，每只接种50万细胞，当肿瘤达到200–400mm3，小鼠被用于活体成像研究；2)分组2周后，将小鼠分为4组，分别为对照组、单纯手术切除组、单纯光动力组和手术切除联合光动力组，每组5只；3)手术联合光动力杀伤残余肿瘤术前12小时将制备好的荧光纳米粒子溶液尾静脉注射入各组小鼠体内，各组小鼠体的实施方法是：假手术对照组，暴露肿瘤之后不手术，不光照；单纯手术组，只手术切除3/4的肿瘤组织；单纯光动力组，暴露肿瘤之后不手术，直接光照15分钟；手术联合光动力组，手术切除3/4的肿瘤组织；然后利用白光进行照射15分钟，然后分别进行肿瘤大小的监控；4)背部再次接种同种肿瘤细胞在确定实验组肿瘤消失之后，各组小鼠背部再次接种同种肿瘤细胞，继续监测后续接种的肿瘤发展。...

【技术特征摘要】
1.一种光动力疗法辅助手术治疗小鼠乳腺癌细胞的试验方法，步骤如下：（1）荧光纳米粒子溶液的制备将聚乙二醇4毫克和具有聚集诱导发光性质的光敏剂TPE-DCM1毫克溶于1毫升四氢呋喃(THF)中，在超声破碎仪中将这1毫升溶液缓慢逐滴地加入9毫升的超纯水中制成10毫升纳米溶液体系，之后将溶液中的四氢呋喃(THF)吹掉，得到澄清的荧光纳米粒子溶液；（2）小鼠乳腺癌细胞培养将处于对数生长期的肿瘤细胞经胰酶消化后，用pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液洗涤一次，用无血清的培养基重悬细胞；在37℃、含5％的二氧化碳的一个潮湿的环境中，将小鼠乳腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素的DMEM培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)中。（3）实验方法1)接种将六周龄小鼠进...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁丹，陈超，朱志朋，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12