使用HPLC定量测定具体组成肝素或低分子量肝素的方法技术

分析肝素或低分子量肝素的方法，其特征在于通过肝素酶的作用使检测的样品解聚，且然后如果合适，还原获得的解聚物且然后通过高效液相色谱法进行分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术的实施方案为检测分级分离的肝素或未分级分离的肝素的样品中具有1-6脱水结构或乙酰化糖类的成分或对其进行定量的方法。肝素为糖胺聚糖族的生物活性剂，提取自天然来源并且具有抗凝和抗血栓形成特性。它们特别用于治疗术后静脉血栓形成。为了从肝素源中产生低分子量肝素(LMWH)，必须将较长的肝素多糖链打断成较短的低分子量链。这一过程可以通过化学或酶的解聚来进行。结果可以为约5,000Da的LMWH多糖链的平均分子量。LMWHs，如未分级分离的肝素通过结合沿多糖链中的某些分布的特定戊多糖序列上的ATIII来抑制凝固。每个经批准的产品的LMWH制造商均使用不同的解聚方法。除非两个制造商使用相同的方法，否则这种方法的差别产生具有不同化学结构的LMWHs和由此的不同药理学活性和不同的经批准的临床应用适应征。所得的LMWHs因用于其制备的解聚方法的不同而在结构上存在差异(R.J.Linhardt等，Seminars in Thombosis and Hemostatis1999；25(3 Supp.)5-16)。结果是LMWHs比肝素更具有不均匀性。每种不同的方法对多糖链产生了独特和高度复杂的结构修饰。这些修饰包括链长和链序列以及结构指纹的差异。因此，不同的LMWHs可能具有不同的药理学特性和不同的经批准的临床适应征。依诺肝素钠购自Aventis并且在美国以依诺肝素钠注射剂形式销售，商标为Lovenox(在某些其它国家中为Clexane)。一般来说，通过对来源于猪肠粘膜的肝素苄基酯进行强碱降解获得依诺肝素钠。例如，其结构的特征在于该链非还原端上的2-O-磺基-4-烯吡喃糖基糖醛酸基和还原端上的2-N，6-O-二磺基-D-葡糖胺。平均分子量约为4500道尔顿。分子量分布为＜2000道尔顿 ≤20％2000-8000道尔顿≥68％＞8000道尔顿 ≤18％在制备依诺肝素钠的过程中，存在葡糖胺的6-O-脱硫酸盐，导致形成称作“1，6脱水”的衍生物(国际专利申请WO 01/29055)，如下所示 这种类型的衍生物仅对末端葡糖胺为6-O-硫酸化的寡糖链获得。末端被1，6-脱水键修饰的寡糖链的百分比为依诺肝素钠的寡糖混合物的结构特征，并且应能够测定它。基于现有的知识，依诺肝素钠中15％-25％的成分在其链的还原端上带有1，6-脱水结构。本专利技术的一个实施方案由此提供了用于分析未分级分离的肝素和分级分离的肝素的方法。本文所用的“分级分离的肝素”指的是任意进行解聚的肝素，例如低分子量肝素(LMWH)，包括依诺肝素钠和正在依据引证Lovenox/Clexane(依诺肝素钠注射剂)作为列举药物的申请寻求管理机构批准的任意LMWH。在一个实施方案中，本专利技术的分析方法如下通过肝素酶的作用使检测的样品解聚，如果合适，然后还原获得的解聚物，且然后通过高效液相色谱法进行分析。如上所述方法由此的特征在于分析解聚物以便检测末端被1，6-脱水键(“1，6-脱水基”)修饰的寡糖链的存在。在相关的实施方案中，首先使用肝素酶，例如肝素酶1(EC 4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)，例如使用各自以0.5个单位/ml存在的肝素酶的混合物使检测的样品完全解聚。(这些酶由Grampian Enzymes集团销售)。本专利技术的主题由此为用于分析未分级分离的肝素或分级分离的肝素的方法，包括下列步骤(a)通过肝素酶的作用使样品解聚；(b)如果合适，还原解聚物；(c)通过高效液相色谱法分析步骤(a)或(b)的样品。在一个实施方案中，本专利技术的主题为如上所述方法，其中肝素酶为肝素酶1(EC 4.2.2.7.)，肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC 4.2.2.8.)的混合物形式。然后处理由此制备的解聚物以便减少非1，6-脱水形式的还原端(专利申请WO01/72762中所述产品)。在一个实施方案中，用在乙酸钠中的NaBH4溶液处理解聚物以便减少非1，6-脱水形式的还原端。最终，为了能够对下述的二糖类1和2进行定量，可以通过还原剂，诸如，NaBH4的作用还原使用肝素酶解聚的低分子量肝素的样品。本专利技术的主题由此为如上所述方法，其中随后还原解聚的肝素。本专利技术的主题还在于如上所述方法，其中所述还原剂为NaBH4。还可以使用其它硼氢化物的碱金属盐，诸如锂或钾盐。本专利技术的检测方法能够清楚地区分依诺肝素钠与其它不含“1，6-脱水”衍生物的低分子量肝素。相反，本专利技术的方法能够确定低分子量肝素不具有依诺肝素钠的物理化学特征并且由此在性质上不同。例如，本专利技术的方法应用于样品的工序间控制过程中的工业化方法中，以便提供制备依诺肝素钠的标准化方法并且获得均匀批量。在酶解聚和可选的还原端还原后，依诺肝素钠的1，6-脱水衍生物以4种主要形式存在，即二糖1、二糖2、二糖3和四糖1。本专利技术的主题由此还在于如上所述方法，其中在解聚反应过程中获得的1，6-脱水残基包括如下部分 二糖 1二糖 2 二糖 3 四糖 1末端二糖单元上含有1，6-脱水端并且在所述末端二糖的糖醛酸上不带有2-O-硫酸盐的寡糖类或多糖类被肝素酶完全解聚并且为二糖1和2的形式。另一方面，当末端糖在糖醛酸上含有2-O-硫酸盐并且当它为甘露糖胺形式时，1，6-脱水衍生物为四糖1形式(耐肝素酶的形式)。三糖1(参见下文)也可以存在于混合物中。它来源于另一个产生如下结构的降解过程(在依诺肝素钠的化学解聚过程中观察到的剥离现象)。 三糖 1混合物中的其它成分并非是依诺肝素钠的惟一特征。当然存在肝素链的8种基本二糖类。这8种基本二糖类特别由Sigma公司销售。通过本专利技术的方法鉴定混合物中的其它二糖类二糖ΔIISgal和ΔIVSgal，它们具有作为其来源的-IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和-IdoA(2S)-GlcNS-的碱2-O-脱硫酸化物，从而形成2半乳糖醛酸。它们通常并不存在于肝素的原始结构中(U.M.Desai等，Arch.Biochem.Biophys.，306(2)461-468(1993))。 含有3-O-硫酸化葡糖胺类的寡糖类耐肝素酶裂解并且保持以四糖类的形式存在。就大部分低分子量肝而言，肝素提取自猪粘膜并且这些主要的四糖类以如下形式为代表。这些四糖类耐酶解聚并且反映出对抗凝血酶III具有亲合性的序列。如下标记这些四糖类ΔIIa-IIsglu和ΔIIa-IVsglu。(S.YAMADA，K.YOSHIDA，M.SUGIURA，K-H KHOO，H.R.MORRIS，A.DELL，J.Biol.Chem.；270(7)，4780-4787(1993))。 使用肝素酶裂解的混合物中的最终成分为葡糖丝氨酸末端ΔGIcA-Gal-Gal-Xyl-Ser(K.Sugahara等，J.Biol.Chem.；270(39)，22914-22923(1995)；K.Sugahara等；J.Biol.Chem.；267(3)，1528-1533(1992))。后者一般几乎不存在于依诺肝素钠中(参见实施例5中的NMR)。 本专利技术在另一个方面中提供了检测1，6-脱水基团的方法。在一个实施方案中，所述方法包括分离解聚后获得的各种寡糖类并且可选地用还原剂，诸如本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于对选自未分级分离的肝素和分级分离的肝素的物质样品中成分的量进行定量的方法，包括：（ａ）通过酶方法使所述样品解聚；和（ｂ）通过高效液相色谱法检测步骤（ａ）的解聚样品中的成分的量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P穆里耶，C维斯科夫，
申请(专利权)人：艾文蒂斯药品公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]