一种红叶卫矛多倍体细胞育种技术制造技术

本发明专利技术涉及一种红叶卫矛多倍体细胞育种技术。本发明专利技术属于植物倍性育种领域，涉及红叶卫矛体细胞诱导培育三倍体植株的方法，包括在无菌培养条件下用红叶卫矛种子的胚乳诱导愈伤组织、游离原生质体并分选出三倍体原生质体、将三倍体原生质体诱导培养形成三倍体植株的过程和方法；还包括三倍体红叶卫矛植株顶芽休眠解除的过程和方法。本发明专利技术从红叶卫矛二倍体野生植株种籽胚乳的大量二倍体细胞中分选富集三倍体细胞，培育形成三倍体小植株并促其生长。

A red leaf Euonymus polyploid cell breeding technology

The invention relates to a red leaf Euonymus polyploid cell breeding technology. The invention belongs to the field of plant ploidy breeding, and relates to a method for red cells cultivation of triploid plants of Celastraceae, including in sterile culture conditions of red leaf Euonymus seed endosperm callus induction, protoplasts and choose triploid protoplast, protoplast culture of triploid induction process and method of forming process and method of triploid plants; the leaves of triploid Plant Euonymus bud dormancy release also includes. The present invention from a large number of diploid cells in diploid wild plant seeds of Euonymus leaf endosperm in enrichment of triploid cells, foster the formation of triploid plantlets and promote its growth.

【技术实现步骤摘要】
一种红叶卫矛多倍体细胞育种技术
本专利技术属于植物倍性育种领域，为红叶卫矛三倍体细胞工程育种方法。涉及野生红叶卫矛种子胚乳细胞诱导形成愈伤组织；游离原生质体，染色及倍性分选三倍体原生质体；原生质体诱导再生小植株；小植株顶芽休眠解除等进程和方法。
技术介绍
红叶卫矛（Euonymusalatus‘Compactus’）是卫矛科卫矛属落叶灌木，树枝幼时绿色、无毛，老枝上有木栓质的翅。花浅红或浅黄色。春夏季叶片深绿色，秋季变为紫红色或火红色故称‘火焰卫矛’，作为园林花木孤植、列植、群植于景区、校园、庭院、湖旁、草坪中，具有极高观赏价值（刘艳霞，2015），乔灌搭配群体绿化具有万山红遍层林尽染之感。红叶卫矛抗旱，耐瘠薄，抗寒－34.4℃，在美国广为栽培。由于该树种适应性强，繁殖能力、生存能力强，在21个州已列为入侵种。康涅狄克大学新英格兰地区入侵物种研究中心改良E.alatus‘Compactus’，获得三倍体植株，拟取代野生二倍体或通过种子繁育的群体，已申报美国国家专利保护。目前，人工培育三倍体的主要方法是通过四倍体与二倍体杂交、胚乳细胞离体培养后筛选、2n配子诱导后杂交等方式（苏静，等，2012）。其中胚乳作为多倍体细胞混合组织，其内含有天然的三倍体细胞，对其进行培养诱导再生植株，可从中筛选出三倍体植株。此方法已用于多种植物的三倍体育种，如柑桔（王大元，张进仁，1978）、猕猴桃（黄贞光，等,1982）、枸杞（米佳丽，等,2011）、巴戟天（姚焱，等,2015）等。康涅狄克大学新英格兰地区入侵物种研究中心即是采用胚乳离体培养的方式，经过愈伤组织及其不定芽的诱导，获得再生植株，最后对其进行倍性筛选，获得三倍体植株（Thammina,etal.,2011）。在该实验中，成熟胚乳诱导产生愈伤组织的诱导率为14.0%；愈伤组织诱导再生不定芽（植株）的诱导率为13.4%；其中，三倍体植株占28.6%，成熟胚乳细胞形成三倍体植株的几率为0.34%；若采用未成熟胚乳进行离体培养，形成三倍体植株的几率为0.42%.该实验流程简单易行，便于操作，但工作量大，愈伤组织及不定芽诱导率低，且胚乳组织中多数为二倍体细胞，再生植株中三倍体植株比率较小。由于流式细胞仪可高效检测颗粒样品所带荧光强度，因而在植物DNA含量检测与倍性分析中得到广泛应用。虽然未见流式细胞仪用于植物细胞倍性分选的相关报道，但已有人利用流式细胞仪分选有活力的原生质体（郭艳萍，等，2014）。Hoechst33342为一种活体DNA荧光染料，可与活体DNA特异结合，在紫外光下发射蓝色荧光。鉴于植物细胞壁在紫外光下亦产生蓝色的自发荧光，因而进行倍性分选的植物材料宜选用原生质体。而Hoechst33342染色并不影响原生质体活力，可培养形成愈伤组织（vanderValk,etal,1988）。因此，可利用流式细胞仪分选三倍体细胞进行培养诱导再生植株，提高三倍体植株所占比率。我国2012年立项引进美国三倍体红叶卫矛培育技术。通过引进、消化、吸收过程，对原技术进行改良、优化和创新形成在育种工艺、配方和效率等方便获得改进和提升的新的育种技术体系。基于多倍体胚乳愈伤组织直接诱导小植株从中筛选三倍体植株的育种程序，本研究用多倍体胚乳愈伤组织游离原生质体，利用流式细胞仪分选三倍体原生质体进行培养，精准诱导三倍体植株再生，三倍体植株获得效率在0.42%基础上大大提升。小植株顶芽休眠解除在以低温处理基础上研发了植物生长调节剂整合低温处理和容器苗技术，休眠解除效率提高到90%以上，且为容器苗，移栽成活率得到保证。
技术实现思路
本专利技术要点一，提供了一种红叶卫矛胚乳愈伤组织诱导方式。其愈伤组织诱导培养基成分包含基本培养基：MS无机盐，维生素B10.1-1.0mg/L、维生素B60.1-0.5mg/L、烟酸0.1-0.5mg/L、甘氨酸1.0-2.0mg/L、水解酪蛋白0.3-0.6g/L、吗啉乙磺酸0.5-1.0g/L；植物生长调节剂：6-BA1.0-3.0mg/L、NAA0.5-2.0mg/L；蔗糖20-30g/L；琼脂6-8g/L。胚与胚乳黑暗条件下室内共同培养4周后，将胚剥离，胚乳转接至愈伤组织诱导培养基上继续黑暗培养。胚伴随的胚乳愈伤组织诱导率远高于无胚伴随的胚乳愈伤组织诱导率，可达80%。本专利技术要点二，提供了红叶卫矛愈伤组织游离原生质体的酶解方法。其酶解液成分包含原生质体洗涤液：KH2P0420-27.2mg/L、KNO390-101mg/L、MgSO4▪7H2O180-246mg/L、KI0.10-0.16mg/L、CuSO40.010-0.025mg/L、CaCl2▪2H2O1000-1480mg/L、甘露醇0.5-0.7M/L、吗啉乙磺酸5-25mM/L；细胞壁水解酶：纤维素酶1.0-2.0%、离析酶0.5-1.0%、果胶酶0.5-1.0%；HCl1M/L和NaOH1M/L水溶液用于调节pH值为5.2-5.8。其酶解条件为黑暗条件下25-29℃酶解4-8小时，期间每小时轻柔颠倒混匀一次。本专利技术要点三，提供了一种红叶卫矛原生质体DNA染色及倍性分选的方法。胚乳愈伤组织与叶片愈伤组织分别游离原生质体后进行DNA染色，染色液为浓度5-10μg/ml的Hoechst33342，染色时间为3-5min。原生质倍性分选，原生质体用原生质体洗涤液清洗后，以叶片愈伤组织的原生质体为二倍体对照，在无菌条件下利用流式细胞仪分选胚乳愈伤组织原生质体内的三倍体细胞，使其得到富集，从而提高其后不定芽诱导过程中三倍体植株的再生机率。注：Hoechst33342为活体DNA染色剂，可特异性结合在DNA双链上，染色后不影响原生质体活力。本专利技术要点四，提供了一种红叶卫矛原生质体再生植株的方法，包括三个连续阶段。阶段1，原生质体培养形成愈伤组织。在无菌条件下将分选的原生质体与含低熔点琼脂糖（凝固点为26~30℃）的原生质体培养基混匀后，倾倒于5cm培养皿内，四等分后，转入含原生质体培养基的9cm培养瓶内。原生质体培养基成分包括上述专利技术要点一所述的基本培养基、甘露醇0.5M、6-BA0.5-2.0mg/L、NAA0.5-1.0mg/L。黑暗条件下24℃震荡培养；形成愈伤组织块后，将其转接至愈伤组织诱导培养基上。阶段2，愈伤组织诱导再生不定芽。将愈伤组织接种在不定芽诱导培养基上，在24℃，光照强度36μmol·m-2·s-1，光照时间16h/d条件下培养8周，诱导形成不定芽。不定芽诱导培养基成分包括上述专利技术要点一所述的基本培养基；植物生长调节剂6-BA2.0-6.0mg/L、IBA0.1-0.2mg/L；琼脂0.6-0.8g/L。阶段3，不定芽诱导生根形成小植株。不定芽以两步法诱导生根。第一步，不定芽在生根培养基Ⅰ上培养2周。生根培养基Ⅰ为½WPM+硝酸铵0.4-1.0g/L+蔗糖20-30g/L+IBA1.0-3.0mg/L，pH为5.8。第二步，经过第一步培养的不定芽转接至生根培养基Ⅱ上培养4周形成根系。生根培养基Ⅱ成分为½WPM+硝酸铵0.4-1.0g/L+蔗糖20-30g/L+活性炭2.0-4.0g/L，pH为5.8）。本专利技术要点五，提供了一种红叶卫矛多倍体细胞获得的小植株顶芽休眠的解除方法。上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红叶卫矛多倍体细胞育种技术，其特征在于：a)野生红叶卫矛种子胚乳离体诱导愈伤组织；b)原生质体培养形成小植株；c)小植株顶芽休眠解除。

【技术特征摘要】
1.一种红叶卫矛多倍体细胞育种技术，其特征在于：a)野生红叶卫矛种子胚乳离体诱导愈伤组织；b)原生质体培养形成小植株；c)小植株顶芽休眠解除。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于一种愈伤组织诱导培养基，包含基本培养基：MS无机盐、维生素B10.1-1.0mg/L、维生素B60.1-0.5mg/L、烟酸0.1-0.5mg/L、甘氨酸1.0-2.0mg/L、水解酪蛋白0.3-0.6g/L、吗啉乙磺酸0.5-1.0g/L、蔗糖20-30g/L；植物生长调节剂：6-BA1.0-3.0mg/L和NAA0.5-2.0mg/L；琼脂6-8g/L。3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于一种红叶卫矛愈伤组织游离原生质体的酶解方法，酶解液成分包含原生质体洗涤液：KH2P0420-27.2mg/L、KNO390-101mg/L、MgSO4▪7H2O180-246mg/L、KI0.10-0.16mg/L、CuSO40.010-0.025mg/L、CaCl2▪2H2O1000-1480mg/L、甘露醇0.5-0.7M/L、吗啉乙磺酸5-25mM/L；细胞壁水解酶：纤维素酶1.0-2.0%、离析酶0.5-1.0%、果胶酶0.5-1.0%；HCl1M/L和NaOH1M/L水溶液用于调节pH值为5.2-5.8。4.按照权利要求1和3所述的方法，其特征在于一种红叶卫矛原生质体倍性的分选方法，原生质体DNA染色，染色液为浓度5-10μg/ml的Hoechst33342，染色时间为3-5min；原生质倍性分选，原生质体培养液清洗染色的原生质体，用流式细胞仪，在无菌条件下分选出三...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华芳，卜祥潘，王蒙蒙，邓舒雨，修宇，唐文思，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11