一种扁桃花药细胞的立体染色方法技术

本发明专利技术公开了一种扁桃花药细胞的立体染色方法，用提前10分钟配制好的铁苏木精溶液，对常规石蜡切片法处理好的扁桃花药切片进行染色，能使扁桃花药的花粉粒细胞、绒毡层细胞、中层细胞、药隔处细胞、药室内壁细胞、表皮细胞、连接组织处细胞和花丝清楚着色，且不同部位细胞之间着色程度不一样，具有立体染色效果，可用于研究扁桃花药内部结构变化以及花药发育过程。

【技术实现步骤摘要】
一种扁桃花药细胞的立体染色方法
本专利专利技术了一种扁桃花药细胞的立体染色方法，用提前10分钟配制好的染液对常规石蜡切片法处理好的扁桃花药切片进行染色，能使扁桃花药的花粉粒细胞、绒毡层细胞、中层细胞、药隔处细胞、药室内壁细胞、表皮细胞、连接组织处细胞和花丝清楚着色，且不同部位细胞之间着色程度不一样，具有立体染色效果，可用于研究扁桃花药内部结构变化以及花药发育过程。
技术介绍
扁桃起源于中亚细亚的沙漠边缘和低山带，一般认为扁桃和桃有共同的祖先。数百万年前地壳运动形成的山系将中国、蒙古和中亚分开，从那时起桃向东进入中国的高湿度、低海拔地区，而扁桃向西扩散形成了许多亚种，这些亚种主要分布在沙漠边缘和较低的山坡上，由于上述地区多是崎岖不平的中海拔地区，冬天潮湿、温和，夏季炎热、干燥，这些早期亚种通常树形矮小、多刺，所结果实较小、壳硬、味苦。中国扁桃主要分布在新疆维吾尔自治区的喀什地区，在库尔勒、阿克苏、阿图什、和田等地区也有零星栽培，以上地区主要以鹰咀、纸皮、麻壳、晚丰、双果、寒丰等当地品种为主，也有少量引进品种如Nonpareil、Mission等。新疆维吾尔自治区林业部2006年的数据显示，新疆扁桃多以农林间作模式栽培，面积约9647hm2，总产量约721吨，且许多二三十年生大树的平均株产量仅有1-2kg，远不能满足国内人民的需要。据美国2011年扁桃年鉴记载，加利福尼亚的扁桃产业几乎供应了美国国内需要的全部，而且其贸易出口量占全球贸易出口量的80%；美国2012年的扁桃年鉴数据显示，中国(没有包括台湾地区)2007年从美国进口扁桃达0.466亿镑，2008年达到0.997亿镑，2009年达到1.330亿镑，2010年达到1.676亿镑，2011年达到2.360亿镑，并且有持续升高的趋势。基于上述我国南疆地区有广泛的适合扁桃栽培的区域，但扁桃春季容易受冻害影响，导致花蕾受冻严重，花药不能正常发育，可利用的花粉量少，产量较低不能满足国内人民需要，所以很有必要对扁桃的花药细胞内部结构、花药发育过程进行研究。而目前国内科学工作者在对扁桃花药研究过程中所使用的方法主要是艾氏苏木精整体染色法，但艾氏苏木精整体染色法配制溶液较为复杂，一般需要敞口后熟2个月以上，染色时间不宜把握，而且对纤维素染色较重，不能很好地观察花药内部各种细胞的结构。基于上述情况，本实验室专利技术了一种扁桃花药细胞立体染色方法，用于研究扁桃花药内部结构变化以及花药发育过程。
技术实现思路
针对传统艾氏苏木精染色方法配制溶液较为复杂，一般需要敞口后熟2个月以上，染色时间不宜把握，而且对纤维素染色较重，不能很好地观察各种细胞的结构的缺陷，本专利技术要解决的问题是提供一种操作简便的花药细胞立体染色方法，能使扁桃花药的花粉粒、绒毡层细胞、中层细胞、药隔处细胞、药室内壁细胞、表皮细胞、连接组织处细胞和花丝清楚着色，且不同部位细胞之间着色程度不一样，具有立体染色效果。为解决上述难题，本新疆特色果树研究中心进行了多次试验，专利技术了一种扁桃花药细胞立体染色方法，与传统的艾氏苏木精整体染色方法相比，本专利方法具有以下优点:1.本专利技术方法能将花粉粒细胞、裂口组织细胞和绒毡层细胞染成深褐色，表皮细胞和药室内壁细胞染成淡褐色，连接组织处细胞染成黑色，花药内各种细胞清楚着色，区分明显，具有立体染色效果。2.本专利技术方法操作简便，对染色时间要求不严格。3.本专利技术方法节约时间和材料，不需要载玻片即可直接观察，且各部位细胞、组织清楚可见。附图说明图1.扁桃花药染色效果图说明：图中1是表皮细胞，2是药室内壁细胞，3是中层细胞，4是绒毡层细胞，5是裂口组织处细胞，6是花粉粒，7是连接组织处细胞，8是花丝。具体实施方法1样品固定：将扁桃花芽固定在FAA固定液中，每3天更换一次固定液，更换3次之后，将样品保存在4±0.5℃冰箱内（FAA固定液配制方法是70%无水乙醇:冰乙酸:40%甲醛溶液=89:5:6）。2试剂：5%苏木精无水乙醇、30%过氧化氢溶液、碘-碘化钾溶液和10%三氯化铁溶液，1.5%三氯化铁溶液。碘-碘化钾溶液配制方法是将2g碘化钾溶解到50ml热蒸馏水中，碘化钾充分溶解后再加入碘0.8g，完全溶解后方可使用。3染液配方：将5%苏木精无水乙醇、30%过氧化氢溶液、碘-碘化钾溶液和10%三氯化铁水溶液按照10:1:10:15的体积比进行混合，10分钟后对处理好的花药切片进行染色。4操作步骤：（1）脱水取出FAA固定液中的样品，先用50%乙醇清洗10分钟，然后用50%乙醇浸泡1.5小时，70%乙醇浸泡1.5小时（可过夜保存），80%乙醇浸泡1.5小时，90%乙醇浸泡1.5小时，95%乙醇浸泡1.5小时，100%乙醇浸泡1.5小时，100%乙醇浸泡1.5小时。（2）浸蜡将上述样品转移至1/3体积无水乙醇+2/3体积二甲苯的混合液中浸泡1小时，2/3体积无水乙醇+1/3体积二甲苯的混合液中浸泡1小时，纯二甲苯中浸泡1小时，纯二甲苯浸泡1小时，然后样品置于1/2二甲苯+1/2石蜡中，在40℃恒温箱内保存12小时，将烘箱温度调到50℃，加入部分碎蜡，继续烘烤6小时，将烘箱调到62℃，每6小时更换换一次干净的石蜡溶液，一共更换3次。（3）包埋迅速将烧杯内的石蜡液体、样品倒在纸盒内，用解剖针将样品均匀分布，待纸盒内的蜡液冷却后，将纸盒放在冷水中浸泡12小时。（4）切片制作取出冷水中的纸盒，晾干后用手术刀将含有样品的蜡块修成上窄下宽的梯形。用石蜡切片机将样品切成12μm厚，选择含有花丝的花药片段，并将其均匀放到洁净的载玻片上，滴加清水后在38℃展片台上展片1个小时，待蜡带完全展开后转移至38℃烘箱烘烤12个小时。（5）脱蜡将烘干的玻片在纯二甲苯脱蜡10分钟，1/2体积二甲苯+1/2体积乙醇浸泡10分钟，无水乙醇浸泡3分钟，无水乙醇浸泡3分钟，95%乙醇浸泡3分钟，90%乙醇浸泡3分钟，80%乙醇浸泡3分钟，70%乙醇浸泡3分钟，50%乙醇浸泡3分钟，30%乙醇浸泡3分钟，蒸馏水浸泡1分钟。（6）脱色用染液对处理好的切片染色15分钟，然后用1.5%三氯化铁溶液洗去多余的染液，至切片组织呈淡褐色（7）清水处理清水浸泡1min，将载玻片上的大部分清水倒掉，仅余下薄薄一层，擦干净载玻片下表面后放在光学显微镜下拍照（也可盖上盖玻片后，再在光学显微镜拍照）。（8）永久切片制作也可将处理好的切片经90%乙醇浸泡3分钟，纯乙醇浸泡3分钟，1/2乙醇+1/2二甲苯浸泡3分钟，二甲苯浸泡10分钟后取出，在二甲苯挥发一半时，用中性树胶进行封片，制作成永久切片。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种扁桃花药细胞的立体染色方法，其特征是用提前10 min配制好的染液，对常规石蜡切片法处理好的扁桃花药切片染色15 min，再用1.5%三氯化铁溶液洗掉浮色，清水浸泡1min后放在显微镜下拍照，可用于观察扁桃花药的花粉粒细胞、绒毡层细胞、中层细胞、药隔处细胞、药室内壁细胞、表皮细胞、连接组织处细胞和花丝，也可经二甲苯处理后，用中性树胶封片制作成永久切片。

【技术特征摘要】
1.一种扁桃花药细胞的立体染色方法，其特征是用提前10min配制好的染液，对常规石蜡切片法处理好的扁桃花药切片染色15min，再用1.5%三氯化铁溶液洗掉浮色，清水浸泡1min后放在显微镜下拍照，可用于观察扁桃花药的花粉粒细胞、绒毡层细胞、中层细胞、药隔处细胞、药室内壁细胞、表皮细胞、连接组织处细胞和花丝，也可经二甲苯处理后，用中性树胶封片制作成永久切片。2.根据权利要求1所述的染液，其特征在于：将5%苏木精无水乙醇、30%过氧化氢溶液、碘-碘化钾溶液和10%三氯化铁水溶液按照10:1:10:15的体积比进行混合，10分钟后对处理好的花药切片进行染色。3.根据权利要求1所述的提前处理好的扁桃花药切片，其特征在于：用常规石蜡切片法将扁桃花药切成12um厚，经二甲苯浸泡脱蜡10分钟，1/2二甲苯+1/2乙醇混合溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：李疆，李鹏，于辉，田嘉，陆婷，罗淑萍，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65