肽模拟物的快速合成和筛选制造技术

公开了一种运用少量连接步骤快速合成极大量肽类的方法，该方法可结合将这些异类混合物肽类进行筛选的技术，以鉴别具有生物活性的特定肽类。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
建立了一种有关大量小分子肽的快速合成和筛选方法，其目的是获得一种模拟较大天然配体对酶和细胞受体的高键合亲和性和专一性的分子。具有这些特性的分子已被称作“模拟物”，有多种应用潜力。例如，模拟物作为治疗剂颇具吸引力，因为它们代表容易合成的分子。本方法给出了一种天然配体的系统性替代法的另一方法，该原替代法已证明既慢又困难，而且随机筛选与自然配体没有任何已知结构相似性的可能性很低。本方法能迅速同时生产比用传统固相合成方法所得到的数量多的肽类，也提供了一种易于测定和合成纯的具所希望活性的特定序列的方法。本方法比先有技术有几点重要突破。运用相应的固相技术的几篇报道显示该原合成法实际上仅限于一次制造几百个肽，而本方法实际上提供了无数肽的合成方法。近期其它运用固相技术在一个短时间内完成很大数量小分子肽的生产的报道公开了将氨基酸混合物连接到生长肽链上的方法，该方法需要调节混合物中氨基酸的浓度以解决氨基酸的不同相关连接比率问题，以便产生的肽类浓度相等。此外，该方法需要应用多种分析技术，用于测定具所期望活性的精确序列。本方法不同点在于在每一个连接步骤中仅以单个氨基酸或氨基酸组连接，消除了需解决不同氨基酸连接比率的问题，也保证了肽类以等摩尔数产生。本方法还可不经化学分析辨别纯的所需序列和后来的产品。还有其它报道述及将随机合成的低聚核苷酸插入丝状噬菌体中。这种生物合成方法有产生百万小分子肽的潜力，然而只限于生产基因编码的氨基酸，所产生的肽类也只能是线性构型。本专利技术的方法生产的氨基酸包括D-氨基酸或其它被修饰的氨基酸和合成的支链序列，它们是重组DNA方法不可能得到的。与先有技术相比，本方法最重要的也许是能估价肽类在没有基质树脂的干扰下与靶连接位点相互作用的能力。简言之，本专利技术能生产大量小分子肽类，也能容易地辨别具有所需活性的特定肽或肽类并生产这些纯的肽或肽类。本专利技术公开了一种快速合成和筛选大量小分子肽类的方法。本专利技术用生产小分子肽混合物的方法提高了生产模仿天然配体对酶和受体具高键合亲和性和专一性的分子的能力。在自然过程中，在混合物中每一个位置上的每一种指定氨基酸的浓度及其每一种肽的浓度被保持接近于指定比例之内。本方法能生产肽类混合物，这些肽类混合物能在没有树脂基质存在下被试验，不失去快速鉴别具所需活性的特定肽或肽类的能力。肽类混合物由一系列在最后连接位置或在其它所述选定位置包含相同氨基酸的肽类组成，而所述肽类的其余位置是随机的不同氨基酸。为了本专利技术的目的，用本方法所制得的肽序列可以是线性的或支链的结构。本专利技术包括一种合成大量混合物肽类的方法，包括进行肽混合物的第一合成法，这些肽混合物中的每一个由n个氨基酸(或氨基酸组)组成，它是由n步合成所得到的，其中第一步包括分别将氨基酸或氨基酸组和固体支持树脂的等分试样连接，使达到完善程度，接下来的步骤各自包括充分混合连有氨基酸或氨基酸组的树脂等分试样，将该混合物等分，分别将每一氨基酸和氨基酸组与每一等分试样连接，使达到完善程度，如果需要，将每种混和物肽从树脂上切下，以得到在最后连接位置有已知氨基酸的各种肽混合物。这种合成方法可与生物试验结合，以测定具有生物活性的特定肽或肽类的序列。这种结合的方法进一步包括A.进行每一肽混合物的生物活性的第一试验，由此完成第一合成周期。B.使用与第一合成法中使用的相同的氨基酸或氨基酸组进行肽类的第二合成法，在n步连接步骤中，重复第一合成法的n-1步，在第n步，将第一试验中显示的具生物活性的肽混合物末端的氨基酸或氨基酸组与每一肽混合物连接使达到完善程度，如果需要，将每一混合物的肽类从树脂上切下，进行每一肽混合物生物活性的第二试验，以完成第二合成周期;以及C.完成总共n次合成周期步骤以合成完全已知序列的肽。应注意本专利技术包括能用相同的快速合成方法制造具有支链肽的肽类。以混合物形式制造出的这些支链分子也可进行活性试验，具有活性的特定单个分子或多个分子序列可由实际上与线性肽类相同的方式加以鉴定。本专利技术中，说明书和权利要求中使用的术语和缩写词定义如下。术语和缩写词AC-乙酰基Bzl-苄基o-Bzl-苄基酯Bom-苄氧甲基Tos-甲苯磺酰基(4-甲苯磺酰)2Cl-z-2-氯苄氧羰基2，6Cl-z-2，6-二氯苄氧羰基2Br-z-2-溴苄氧羰基X-一种未知氨基酸这里L-氨基酸用三字母码表示其中第一字母大写，而D-氨基酸用均小写的标准三字母码表示。本专利技术可用肽合成中常规使用的固相合成方法来进行。总的来说，最终相应于所生成肽的C-端氨基酸残基的氨基酸靠C-端残基的羧基和树脂基质上作为连接位点的特异功能基之间的共价键固定在一种不溶的支持树脂上。然后从连接在树脂上的C端氨基酸开始，通过连续连接到肽的N-端残基的氨基上的方法形成肽。如果有支链结构存在，则可能存在一个以上N-端残基。整个合成中，肽保持连接在树脂上，但一旦完整的肽序列形成，则可以从树脂上分开。生产含有从2个到8个氨基酸或氨基酸组的肽类的方法是本专利技术优选的实施方案。这种新方法基于反复混合、分开和连于树脂上的氨基酸或肽类的的连接。第一步需要将固体支持树脂分成具有相等数量连接位点的等分试样。接着分别将选定的氨基酸连接到每一等分试样上，使达到完善程度，每一等分树脂连接到不同的氨基酸上。结果每一等分试样树脂连接的氨基酸的摩尔数与其它连接不同的氨基酸的试样连接的摩尔数都是相等的。这些树脂被充分混合以获得连接在树脂上的氨基酸的等摩尔混合物。然后混合物再分成等分试样，接着进一步分别将选定的氨基酸连接到在每一等分试样中的连接在树脂上的氨基酸上。重复混合、隔分和连接各步骤，形成肽混合物，这里最后连接的氨基酸残基在给定混合物中的所有肽中均相同，但混合物中每一种肽其它位置的氨基酸残基代表了一种包括在给定连接步骤中的等摩尔选择氨基酸。此外，单独一种氨基酸可在任一给定连接步骤中被连接，以使所有的合成肽在某一给定位置具有相同的氨基酸。此时，紧接连接步骤之前的隔分步骤和紧接连接步骤之后的混合步骤可以消除。这种方法产生如前的肽混合物，但其中最后连接位置和某一给定位置的氨基酸均是已知的。该方法采用少数连接步骤产生适于进行生物学试验的极大量的肽类。其结果是可通过选定的氨基酸来制造各种可能的序列。例如，如果选用25种氨基酸进行肽类的合成，仅25步反应的两个连续周期的50个连接步骤之后就产生625种二肽;在三个反应周期的75个连接步骤之后产生15，625种三肽，在四个反应周期的100个连接步骤之后产生390，625种四肽，运用较大数量的连接步骤来生产较长的肽类将得到更大量的混合物肽类。选定用来合成的氨基酸数量和种类从一个周期到下一个周期可以不同;可以不设想哪一个属最适宜的氨基酸来进行随机选择，也可以根据已知影响所需活性的特性选择某些特定氨基酸。可用本方法完成的连接连接的数量仅受到本领域公知的肽的固相合成限制因素的影响。然而，须注意到在一个混合物中若增加肽的数目便减少了作为全部肽一部分的单个肽的含量。因此，当肽混合物的合成与如下所述的测定活性肽序列的生物学试验结合时，必须考虑试验灵敏度将由实际可进行的连接的数量所决定。这就是说，从或许大量过剩非活性混合成分的噪音上识别单个肽信号的检测能力将是一种对包含在混合物内的待试活性肽数量的限制因素。当一种检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种合成肽混合物的方法，包括：进行肽混合物的第一合成法，其中每一种混合物由ｎ个氨基酸或氨基酸组所组成，通过ｎ步合成，其中的第一步包括将氨基酸或氨基酸组分别连接到固体支持树脂的等分样上，使达到完善程度；接下来的其它各个步骤包括充分混合连有树脂的氨基酸或氨基酸组各等分；将该混合物隔分成等量等分样，将氨基酸或氨基酸组分别连接到每个等分样上使达到完善程度，如果需要，将每一混合物肽从树脂上切下，以产生其每一成员的最后连接位置氨基酸均已知的肽混合物。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：RD迪马奇，PD格塞尔兴，RA欧文斯，
申请(专利权)人：伊莱利利公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]