90K肿瘤相关抗原IR-95的遗传序列制造技术

本发明专利技术提供了基本纯化的肿瘤相关９０Ｋ抗原，或其片段，特别是来自：人乳腺癌细胞系ＣＧ－５的培养液；乳腺癌患者的血清；或卵巢癌患者的腹水。分子量约为９５，０００道尔顿的天然抗原以高分子量复合物存在。本发明专利技术还提供了该抗原的纯化和表征以及它们的应用。本发明专利技术还提供了编码９０Ｋ抗原或其片段的核苷酸序列，含有该基因序列的载体，以此转化的宿主，和由转化的宿主生产该抗原或其片段的方法。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属分子和细胞生物等领域，涉及90K肿瘤相关抗原(IR-95)的纯化及鉴定、编码90K抗原的遗传序列、该抗原的克隆和表达以及其生产和应用。在各种癌病患者的血清中已有肿瘤细胞排出或分泌的抗原的报道。对某些类分子的免疫检测显示，它们可用作诊断/预测指示剂，并可用于治疗性监视。部分已被鉴别的抗原包括用于卵巢癌的CA125(Bast dt al.N-Ergl.J.Med，309883-887(1983));用于卵巢癌的MOV2(Miotti et al，Cancer Res.45826-832(1985));用于乳腺癌的CA15-3(Hilkens et al.，Cancer.Res.462582-2587(1986));用于胃肠癌的CA19-9(Koprowski et al.，Scicnve21153-55(1981));用于胃肠癌的癌胚抗原(CEA)(Golp et al.，JAMA2341331-1334(1968));以及用于胃肠癌的CA50(Holmgren et aal.，Br.Med.J.2881479-1492(1984))。但是，在所有这些肿瘤抗原血清检测方法中没有一种灵敏到足以对潜伏的癌症进行早期检测，或者对其复发或转移进行检测。这类抗原大部分是表达在肿瘤细胞的表面，但也有一些被分泌到患者的循环系统中。其中后一类抗原已被证明可用于对肿瘤负荷及癌症的发展进行血清检测、预测和评估。检测肿瘤相关抗原的单克隆抗体(MAb)已有报道。例如，已获得抗循环乳腺癌相关抗原的单克隆抗体。其中的sp-2能够识别一种称作90K抗原(a.k.a ImmunoRegulin-95或IR-95)的细胞质抗原。90K抗原在80%以上的乳腺癌中均有表达(Iacobelli et al.，Cancer Res.463005-3010(1986))。在约50%乳腺癌患者、40%胃肠癌患者及30%妇科癌症患者的血清中，90K抗原的水平均有升高(Iacobelli et al.，Breast Cancer Res&Tneat.1119-30(1988))。更重要的是，本专利技术的检测方法已显示在患有转移性疾病的个体中，显示出血清水平提高的患者的百分数更大，且90K血清变化与癌症的发展状况相对应(Iacobelli et al.，Breast Cancer Res&Tneat.1119-30(1988);Scanbia et al.，Anticancer Res 8761-764(1988);Beneketti-Panici et al.，Gynecol.Oncol.35286-289(1989))。由于90K抗原不同于其它循环抗原，如CA15-3、CEA和CA125(Jacobelli et al.，Breast Cancer Res&Tneat.1119-30(1988);Benedetti Panici et al.，Gynecol.Oncil.35286-289(1989))，它可以代表另一种有用诊断工具，用以对乳腺癌及其它癌症进行监测。引用I型巨噬细胞清除剂受体(Kolana et al.，Natwve 343531(1990))、海胆Speract受体(Dangott et al，Proc.Natl.Acda.Sci.usA862128(1989))和人淋巴细胞糖蛋白T1/Leu-1(Jones et al.，Nature323346(1986))，已发现了90K抗原中氨基酸35-80区域的同源性。90K抗原在欧洲专利申请91830153.2(1991年4月17日递交，公开号为0453419A2)中有所涉及。具有相同的15氨基酸末端序列的抗原则在PCT申请PCT/US85/02132(1985年10月30日递交，国际公开号为WO86/02735)中有所涉及。该PCT申请要求了1984年11月2日和1985年10月7日递交的美国专利申请667，521和785，177的优先权。但是，迄今没有一项研究具体阐明了该抗原的物理化学性质和免疫化学性质。因此，对sp-2反应性90K抗原进行纯化和鉴定十分重要。本申请涉及的是以下来源的90K肿瘤相关抗原的纯化和鉴定人乳腺癌细胞系的培养液、乳腺癌患者的血清以及卵巢癌患者的腹水液。所提供的纯化方法产生了至少50，000倍纯化的三种不同来源的90K肿瘤相关抗原。天然抗原是糖蛋白，表观分子量约为95，000道尔顿，并且是以高分子量复合物形式存在，所有三种不同来源的抗原具有相似的电泳图和免疫反应性。本专利技术还涉及90K抗原的氨基酸序列以及编码90K抗原的遗传序列，也提供了90K抗原的诊断和治疗用途。附图说明图1显示了90K蛋白的核苷酸和氨基酸序列(分别为SEQID-NO1和SEQ ID NO2)。信号肽以方框显示，SRCR同源区以阴影显示，潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点以圆圈显示。图2显示了对以下来源的90K抗原进行琼脂糖CL-6B柱层析的结果CG-5组织培养液(-)、乳腺癌患者的血清(┄)以及卵巢癌患者的腹水液(┄)。通过免疫放射检测法(IRMA)检测各级分的90K活性，箭头表示Dextran blue2000的洗脱体积。图3显示了对90K抗原进行密度梯度离心的结果，将得自CG-5培养液(-)、乳腺癌患者血清(…)、卵巢癌患者腹水液(…)以及乳腺癌患者未分离血清的纯化90K在氯化绝中进行平衡超离心。通过IRMA检测各级分的90K活性并通过称量已知体积的各级分测定其密度。箭头表示β-半乳糖苷酶的浮力密度。图4是对90K抗原的分子量进行测定。图4A对来自人乳腺癌细胞的放射活性90K抗原进行免疫沉淀。利用MAb sp-2(泳道a-e)或抗α-胎蛋白MAb(泳道f)免疫沉淀(200，000cpm三氯乙酸可沉淀的)(35S)甲硫氨酸标记的培养液等份试样，并在2-巯基乙醇存在(泳道a-c和e)式不存在(泳道d)的情况下通过SDSPAGE进行分析，接着进行荧光x线照相。泳道a含有CG-5细胞。泳道b含有MCF7细胞。泳道C含有T47D细胞。泳道d含有T47D细胞。泳道e含有得自与衣霉素接触之后但在被(35S)甲硫氨酸标记之前的CG-5细胞的组织培养液。(图4B)对自CG-5培养液(泳道a，620单位)、乳腺癌患者血清(泳道b，920单位)和卵巢癌患者腹水液(泳道c，700单位)纯化的90K抗原的SDSPAGE分析。凝胶用银染色。分子量标准品为磷酸化酶b(Mr97，000)和BSA(Mr66，000)。图5是对得自CG-5培养液(泳道a和d)、乳腺癌患者血清(泳道b和e)和卵巢癌患者腹水液(泳道c和f)的纯化90K抗原的PAGE和Western吸印分析。在含0.1%NP-40的4-20%梯度凝胶上分析纯化的90K抗原。泳道a-c用银染色。泳道d-f蛋白电吸印到硝酸纤维素膜上，分子量标准品是β-半乳糖苷酶(Mr540，000)和BSA(Mr66000)。图6显示了90K抗原酶促消化的结果。图6A用各种蛋白酶消化得自CG-5培养物的纯化90K并在9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基本纯化的９０Ｋ抗原或其含有抗原决定簇的片段，该抗原或片段能够与单克隆抗体ＳＰ－２结合，ＳＰ－２保藏于法国巴黎巴斯德研究所（ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＮａｒｉｏｎａｌｅｄｅＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉｃｒｏｇａｎｉｓｍｅｓ，ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ），其保藏号为Ｉ－１０８３。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S亚科贝利，C纳托利，J施莱辛格，
申请(专利权)人：纽约大学，GD阿农齐奥基耶蒂研究院，
类型：发明
国别省市：US[美国]