具有非天然二硫键的促性腺激素制造技术

本发明专利技术涉及由α和β亚单位组成的促性腺激素，所述促性腺激素含有非天然二硫桥键。优选的是非天然亚单位间二硫键。本发明专利技术的促性腺激素的稳定性提高。本发明专利技术进一步提供了含有所述促性腺激素的药物组合物。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及促性腺激素，含有所述促性腺激素的药物组合物以及编码所述促性腺激素的DNA。促性腺激素形成一个结构上相关的糖蛋白激素簇。典型的成员包括绒毛促性腺激素(CG)，促滤泡激素(FSH)，促黄体生成激素(LH)和促甲状腺激素(TSH)。FSH，LH和TSH存在于大多数脊椎动物种中，并且是由垂体合成和分泌的。至今为止仅在灵长类动物，包括人，以及在马中发现了CG，并且是由胎盘组织合成的。促性腺激素是由称为α和β的两个不相同的亚单位组成的异二聚体。这两个亚单位是通过非共价键结合的。在一个物种内，对于促性激素簇的各个成员，其α-亚单位基本上是相同的；种与种之间也是高度保守的。对于不同的成员即CG，FSH，TSH和LH，β-亚单位是不同的，但是其结构具有相当高的同源性。此外，种与种之间β-亚单位也是高度保守的。对于人，α亚单位由92个氨基酸残基组成，而β亚单位的大小随不同的簇内成员而变化对hFSH为111个残基，hLH为121个残基，对于hTSH为118个残基，而hCG为145个残基(Combarnous，Y.(1992)，Endocrine Reviews，13，670-691，Iustbader，J.W.等人(1993)，EndocrineReviews，14，291-311)。hCG的β亚单位实质上大于其他β亚单位，其C-末端含有另外的大约34个氨基酸，在本文中将这一段称为羧基末端蛋白(CTP)。异源二聚体的两个亚单位存在许多保守的亚单位内二硫键α-亚单位内有五个二硫桥键并且β-亚单位内有6个二硫桥键。在促性腺激素簇的所有成员中间相应的半胱氨酸残基是完全保守的。最近获得的hCG的X-射线结构显示这些二硫键参与形成了称为二硫结的典型的三维空间图形。促性腺激素具有可以是N-糖基化的三个或四个天冬酰胺残基。另外，hCG的C-末端肽(CTP)在四个丝氨酸位置上可以是O-糖基化。促性腺激素在各种各样的机体的功能包括代谢，温度调节和生殖过程中起着重要的作用。垂体促性腺激素FSH例如在刺激滤泡发育和成熟中起着关键性的作用而LH诱导排卵(Sharp，R.M.(1990)，ClinEndocrinol.，33，787-807，Dorringtonand Armstrong(1979)，Recent Prog.Horm.Res.，35，301-342)。目前，在临床上将FSH单独应用于或与LH活性物一起应用于刺激卵巢即体外受精(IVF)时进行卵巢的过刺激作用以及诱导不育不排卵妇女的体内排卵(Insler，V.(1988)，Int.J.Fertility，33，85-97，Navotand Rosenwaks(1988)，J.Vitro Fert.Embrgo Transfer，5，3-13)，以及应用于男性腺性功能减退症。目前，用于治疗目的的促性腺激素是从人尿中分离到的并且是低纯度的(Morse et al(1988)，Amer.J.Reproduct.Immund.and Microbialogy，17.143)。与这些尿促性腺激素相反，重组促性腺激素具有特性不变的巨大优点，即可重复再现的生化和生物学特性。已经制备了所有亚单位的基团组和cDNA克隆，并已测出了其一级结构。而且，已经用人促性腺激素亚单位基因转染了中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并且已经证明这些细胞能够分泌完整的二聚体(例如，Keene et al(1989)，J.Biol.Chem.，264，4769-4775；Van Wezenbeek at al(1990)，in From clone to Clinic(edsCrommelin D.J.A. and Schellekens H.)，245-251)。从那以后，已经证实了例如重组FSH的生化和生物学特性几乎与天然FSH的特性相同(Mannaerts et al(1991)，Endocrinology，129；2623-2630)。而且，在利用重组FSH控制卵巢过多排卵之后怀孕成功(Germond et al(1992)，Lancet，339，1170，Devroey etal.(1992)，Lancet，339，1170-1171)。两个亚单位成功地集配为二聚体是该二聚体具生物学活性的绝对必要条件。据认为异源二聚体离解为相应的亚单位是体内失去生物学活性的主要原因。再者，例如离解和脱酰胺作用的过程导致其货架期延长。因此据认为异源二聚体的热动力学稳定性是在体内和体外条件下影响促性腺激素半衰期的重要因素。因此，进一步改善促性腺激素的稳定性是临床应用的需要。本专利技术提供了上面所述的促性腺激素。令人惊奇的是发现可将一个或多个非天然二硫桥键导入到促性腺激素中导致所述促性腺激素的稳定性增加。本文中所述的非天然二硫桥键是天然促性腺激素中不存在的二硫桥键，因此非天然二硫桥键并不包括在天然促性腺激素的α亚单位的五个二硫桥键中也不包括β亚单位中的六个二硫桥键。“天然”促性腺激素是那些与从有关组织中分离的促性腺激素具有相同氨基酸序列的促性腺激素。因此，本专利技术提供了由含有一个或多个非天然二硫桥键的α亚单位和β亚单位组成的促性腺激素。通过位点特异性诱变可以导入非天然二硫桥键在相应位置上的天然氨基酸残基点突变为半胱氨酸。将点突变标记为Xαy Cys或Xβy Cys，其中X分别是α或β亚单位相应位置y上的氨基酸残基，它的分别突变为半胱氨酸(氨基酸用三字母密码表示)。标记Cysαy Cys或Cysβy Cys是指天然亚单位中y位的半胱氨酸。本专利技术的点突变导致促性腺激素的构型发生细微的变化。本专利技术范围还包括其中仅导入一个突变的促性腺激素。可以在编码α或β亚单位的DNA中导入这样一种突变，使得到的亚单位中产生能与已经存在的半胱氨酸残基形成二硫桥键的一个新半胱氨酸残基。优选地是在α亚单位中导入这样的突变，更优选地是在88-92位氨基酸中导入这样的突变。本专利技术的非天然二硫桥键可存在于氨基酸残基对之间，其中所述氨基酸残基定位于不同亚单位(亚单位之间)。另外，非天然二硫键也可存在于两个氨基酸残基定位于相同亚单位(亚单位内)的氨基酸残基对之间。非必要步骤，由于存在本专利技术所述的一个或多个非天然二硫键，可以使11个天然二硫桥键中的一个或多个缺失。本专利技术的非天然二硫键阻止二聚体离解，从而相对天然促性腺激素而言，使其在体外和体内有较高的生物稳定性，和改善的货架期。此外，他们降低了促性腺激素多肽主链的伸展性，因此，使这些促性腺激素对脱酰胺作用的敏感性较小。脱酰胺作用是在生理条件下出现的自发过程并且以消极方式影响纯度和蛋白质稳定性。存在非天然亚单位间和亚单位内二硫键的促性腺激素也在本专利技术范围内。其中α亚单位来源于人的本专利技术的合适的促性腺激素包含位于一或多个氨基酸对之间的(Pheα18 Cys-Ileα25 Cys)，(Glnα20Cys-Alaα23Cys)，(Serα34Cys-Serα57Cys)，(Thrα39Cys-Thrα54Cys)，(Alaα62Cys-Hisα79Cys)，和(Lysα63Cys-Alaα81Cys)，(Tyrα65Cys-Hisα79Cys)，和(Asnα66Cys-Asnα78Cys)非天然亚单位内二硫键。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
由α亚单位和β亚单位组成的促性腺激素，其特征在于所述促性腺激素包含一个或多个非天然二硫键。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PDJ格鲁坦胡斯，JC海库普，
申请(专利权)人：阿克佐诺贝尔公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]